Cell：重大突破！首次從結構上揭示CRISPR-Cas3系統作用機制

圖片來自Cell，doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

2017年7月2日/生物谷BIOON/---在一項新的研究中，來自美國哈佛醫學院和康奈爾大學的研究人員獲得來自嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的I型CRISPR複合體的近原子解析度的圖片，揭示出它的作用機制的關鍵步驟。這些發現提供改善CRISPR在生物醫學應用時的效率和準確性所需的結構數據。相關研究結果發表在2017年6月29日的Cell期刊上，論文標題為「Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System」。論文通信作者為哈佛醫學院細胞生物徐助理教授Maofu Liao和康奈爾大學研究員Ailong Ke。

這些研究人員利用冷凍電子顯微鏡技術首次描述出當這種CRISPR複合體裝載靶DNA並讓它做好被Cas3酶切割的準備時準確發生的一系列事件。他們說，這些結構揭示出一種存在多層錯誤檢測的過程，即存在阻止不想要的基因組損傷的分子冗餘（molecular redundancy）。

CRISPR-Cas系統是一種廣泛採用的用於生物醫學研究的精準基因編輯工具。CRISPR-Cas3是CRISPR-Cas系統的一種亞型。然而，它的作用機制，特別是它如何尋找它的DNA靶標是不清楚的，而且對不想要的脫靶效應的擔憂讓人們猜測將CRISPR-Cas用於治療人類疾病是否會存在安全性問題。

當利用這種CRISPR複合體進行基因編輯時，這些結構的高解析度細節闡明了確保精確切割和避免脫靶效應的方法。

Liao說，「為了解決特異性問題，我們需要理解CRISPR複合體形成的每個步驟。我們的研究如今展示了入侵DNA如何被CRISPR捕獲（從起初時的靶DNA識別到一種使得DNA發生構象變化而最終被Cas3切割的過程）的精確機制。」

CRISPR-Cas是一種被細菌用來抵抗病毒入侵的適應性防禦機制。這一過程涉及細菌獲得病毒DNA片段，並將這些片段整合到它的基因組中，並且產生短的被稱作crRNA（CRISPR RNA）的 RNA序列。這些crRNA片段被用來觀察「敵人」的存在。

為了更好地理解CRISPR-Cas如何發揮功能，Liao、Ke和他們的團隊著重關注細菌中最常見的CRISPR亞型：1型CRISPR，即利用一種被稱作CRISPR Cascade的核糖蛋白複合體（riboprotein complex）捕獲DNA，並且利用酶Cas3切割外源DNA。

通過聯合使用生化技術和冷凍電子顯微鏡技術，他們復原出在不同的功能狀態下的穩定的Cascade，並且進一步獲得Cascade在捕獲和加工DNA時解析度低至3.3埃（大約是一個碳原子直徑的3倍）的圖片。

在CRISPR-Cas3中，crRNA被裝載到CRISPR Cascade上，隨後尋找一段非常短的表明外源病毒DNA存在的DNA序列（被稱作PAM）。

Liao、Ke和他們的同事們發現當Cascade檢測PAM序列時，它讓DNA呈銳角彎曲，迫使一小段DNA解鏈。這允許crRNA的一個長11nt的片段結合到靶DNA鏈上，形成一種「種泡（seed bubble）」。

這種種泡發揮一種自動防故障裝置的作用，檢查靶DNA是否匹配crRNA。如果它們正確地匹配，那麼這種種泡就會擴大，crRNA的剩餘部分就與它對應的靶DNA結合，形成一種「R環（R-loop）」結構。

一旦這種R環完全形成，這種CRISPR Cascade複合體經歷一種構象變化，從而將靶DNA鎖定。它也讓DNA的第二條非靶標鏈產生一個凸起，這個凸起被移交到這種CRISPR Cascade複合體的一個不同位置上供Cas3酶切割。

僅當一種完整的R環形成時，Cas3酶才結合和切割在這條非靶標DNA鏈上產生的這個凸起上的DNA。

這些發現揭示出一種精心設計的分子冗餘確保精準切割和避免錯誤地切割細菌自己的DNA。

Ke說，「為了將CRISPR用於人類醫學中，我們必須確保CRISPR系統是準確的，它不會靶向錯誤的基因。我們的觀點是CRISPR-Cas3亞型已進化為一種精準的系統，有潛力成為一種更加精準的用於基因編輯的系統。即便存在錯誤靶向，我們也知道如何操縱這個系統，這是因為我們知道哪些步驟參與其中，以及我們可能在何處進行干預。」（生物谷 Bioon.com）

參考資料：

1.Yibei Xiao, Min Luo, Robert P. Hayes et al.Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System.Cell, 29 June 2017, 170(1):48–60, doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

2.New study reveals key steps in CRISPR-Cas3 function at near-atomic resolution

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