疫苗佐劑評價相關的指導原則及理論書籍分享

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儘管免疫學技術已取得很大的進展，但令人吃驚的是在人類疫苗中還主要依賴鋁為基礎的複合物作為主要的佐劑。疫苗佐劑(Adjuvant)是能夠非特異性地改變或增強機體對抗原的特異性免疫應答、發揮輔助作用的一類物質。隨著疫苗產業的迅速發展，除了傳統的鋁佐劑和最新在流感疫苗獲批的MF59佐劑之外，越來越多的新佐劑受到關注。但其作用機制和安全、有效性評價較為複雜，對監管者、佐劑研發者和使用者均提出一系列挑戰。小編結合自己的專業理解，在網上找到兩個相關的技術指導原則和一本書籍，分享如下。

WHO：Guideline for Nonclinical Evaluation of Adjuvant Vaccines

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該指導原則的適用範圍

該指導原則主要適用於為傳染性疾病防治而研發的佐劑疫苗，包括預防性疫苗和治療性疫苗，但不包括治療非傳染性疾病（如癌症和過敏）的治療性疫苗。與會專家一致同意：由於抗原、佐劑和抗原/佐劑製劑的複雜性，佐劑本身不會得到授權，其必須作為某種含佐劑疫苗的組分去申請授權，而且每一種新的含佐劑疫苗都應當視為一種新的獨立製品，需要進行適當的理化特性、非臨床和臨床評價才可獲批。但從相似產品獲得的已有數據可為非臨床和臨床研究提供重要指導信息。

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候選佐劑和含佐劑疫苗所需的生產和質控信息

為了確保抗原和佐劑具有合適的質量，生產控制（如質量、含量、純度及效力等）及其控制範圍在研究階段和商業化生產階段、以及不同臨床實驗階段均不盡相同。在早期臨床實驗中，應開發合適的分析方法並予標準化。通常包括鑒定和定量檢測一種複雜的含佐劑疫苗中的各種組分（包括抗原、佐劑、其他重要組分以及疫苗中的添加劑）、評價與佐劑活性相關的特性（如外觀、顆粒大小和顆粒大小分布、聚集物的存在、抗原吸附的完全性以及pH）、評價抗原/佐劑兼容性和含佐劑疫苗各組分間物理相互作用等。當然，評價疫苗成品效力的QC實驗也是必須的，但效力試驗可反映也可不反映佐劑對於含佐劑疫苗效力的貢獻大小，如果效力實驗不反映佐劑的貢獻，評價疫苗成品中或單獨包裝的佐劑中佐劑的含量就很重要。應該注意的是，在非臨床研究中所使用的抗原、佐劑和含佐劑疫苗的批次在生產、理化性質、效力和穩定性方面應與臨床用苗相當並具有很好的代表性。在後期臨床研究中，生產者應特別關注成品生產過程有無任何微小的變化，並評價這些變化能否影響產品安全性。隨著臨床研究和產品研發的進行，生產者應當提供對關鍵步驟、中間產品以及初期接受標準進行控制的信息，以確保生產過程在各關鍵點可控。生產者應提供充分證據確保臨床研究將產生可靠的可解讀的數據。

3

非臨床評價應選擇相關實驗動物模型的考慮點

對影響佐劑和含佐劑疫苗的安全性和免疫原性研究，應選擇合適的動物模型。選擇時通常應考慮如下幾點：

1）給葯途徑：毒理學評價所用的給藥方式應當與臨床實驗一致，如臨床試驗使用特殊器械進行給葯，動物實驗也儘可能使用相同器械；

2）基線免疫狀態：應明確界定與安全性評價最相關的基線免疫狀態；

3）理想的動物模型應能重複出人體產生的免疫反應；

4）能夠得到的歷史性數據。在大多數情況下，對於新的佐劑和含佐劑疫苗，一種相關動物模型就足夠了。

但何為相關模型，是個十分複雜的問題。理想狀態下，選擇的動物應當對疫苗所抵抗的細菌、病毒或寄生蟲抗原具有易感性。關於靈長類動物的選擇，專家認為，當有其他種類動物可供使用時，沒有必要使用非人靈長類動物。另外應該注意，由於動物對抗原或佐劑的反應特異性，使用動物模型預測人類免疫反應具有局限性，而且動物研究可能無法檢測到那些罕見的副反應。

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佐劑評價的主要內容點

1）評價體液免疫反應的強度（如抗體平均滴度或濃度）、質量（抗體親和力）以及活性作用（即中和活性）；

2）評價細胞免疫，包括對某種特異的細胞免疫反應誘導的評價，如Th1和Th2型反應、可檢測細胞因子和細胞毒性T細胞的誘導等；

3）評價合適動物模型中的保護作用；

4）闡明佐劑作用模式和免疫調節作用的機理。

上述研究結果將有助於解讀非臨床安全性研究，並確定將來臨床研究中將被檢測的潛在副反應。體外功能性實驗可為了解佐劑的作用模式提供幫助，可提供有價值的補充性數據，如通過檢測抗原遞呈細胞表面受體表達量的改變以及細胞因子的分泌，可對佐劑的作用效果進行評價。

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藥物非臨床安全性評價動物實驗

安全性評價動物實驗對於確定合適的佐劑/抗原比例和安全劑量、免疫方法和給葯途徑，以及確定臨床試驗初期需檢測的未知或潛在不良反應非常重要。由於抗原、佐劑和佐劑疫苗的最終製劑均有可能導致安全問題，佐劑疫苗的安全性評價應包括單獨佐劑的毒性研究和佐劑疫苗的毒性作用。

1）單獨佐劑的毒性研究；

2）佐劑疫苗最終製劑的毒性研究；

佐劑疫苗最終製劑的非臨床毒性研究用於評價疫苗的局部反應原性和全身毒性，進而發現和確定疫苗潛在的不良反應，以推斷疫苗安全性是否達到臨床試驗要求。其中，重複劑量毒性研究最為重要，通常應在一種適當物種（主要是敏感物種）中進行，必要時，可按照不同產品選擇額外物種進行試驗。佐劑疫苗最終製劑的重複劑量毒性研究應全面考慮，周密設計。

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臨床評價早期考慮因素

除了與一般疫苗類似的早期臨床試驗考慮因素外，新型佐劑疫苗臨床評價尚有其獨特的問題需要考慮。

1）儘管一個佐劑疫苗的早期臨床試驗並不需要陰性對照組，但這類接種了無活性鹽安慰劑的對照組有助於初始安全數據的解釋。但從倫理角度，應盡量避免單獨佐劑對照組，而首選安慰劑和單獨抗原製劑組。2）製造商應該提供疫苗中使用佐劑的理由，包括有關添加佐劑好處的臨床前研究信息（如概念驗證研究、攻擊模型數據）、有/無佐劑疫苗的早期臨床安全性和免疫原性研究數據及其增強免疫反應和節約抗原的數據等。

3）由於佐劑本身可能誘發極強的固有免疫反應，以及佐劑對抗原的增強免疫反應均可導致不良事件，評價時應予充分關注。

4）由於新型佐劑可能誘導自體免疫或自身炎症疾病，建議在新型佐劑的臨床試驗中，對所有治療組受試者遲發性自身免疫疾病相關的嚴重不良事件進行監測，檢測時間建議擴展到疫苗接種後12個月，但臨床研究報告的提交和後繼臨床研究的啟動不需因隨訪而推遲。。

歐盟：Guideline on adjuvants in vaccines

該指導原則詳細介紹了歐洲藥品審評署(EMEA)關於人用疫苗佐劑的指導原則。該指導原則闡明了佐劑的定義、分類及其作用機制,並對佐劑的質量研究、非臨床研究和臨床研究提出了具體要求，目錄如下：

CONTENTS

1. INTRODUCTION

2. SCOPE

2.1. Vaccines

2.2. Adjuvants

3. QUALITY

3.1. The adjuvant

3.1.1. Description

3.1.2. Manufacture

3.1.3. Characterisation

3.1.4. Routine testing

3.1.5. Stability

3.2. Adjuvant/antigen combination

3.2.1. Development and manufacture of the combination

3.2.2. Characterisation

3.2.3. Routine testing

3.2.4. Stability

3.2.5. Multiple antigen/adjuvant combinations

3.3. Final product

4. NON-CLINICAL

4.1. Proof of Concept

4.2. Pharmacokinetics

4.3. Toxicity of adjuvant alone

4.3.1. Local tolerance

4.3.2. Induction of hypersensitivity and anaphylaxis

4.3.3. Pyrogenicity

4.3.4. Systemic toxicity

4.3.5. Reproduction toxicity

4.3.6. Genotoxicity

4.3.7. Carcinogenicity

4.3.8. Combination of adjuvants

4.4. Toxicity of adjuvant in combination with the proposed antigen

4.4.1. Local tolerance

4.4.2. Repeated dose toxicity studies

4.4.3. Characterization of the immune response

5. CLINICAL

5.1. Introduction

5.2. Preliminary studies

5.2.1. Effect of the adjuvant on the immunological response

5.2.2. Dose-finding studies

5.3. Confirmatory trials

5.3.1. General considerations

5.3.2. Possible scenarios

5.3.2.1. New vaccines with a new or established adjuvant

5.3.2.2. Changes to the adjuvant content of a licensed vaccine

5.3.3. Statistical considerations

佐劑書籍：Vaccine Adjuvants：Methods and Protocols

Edited by Gwyn Davies

St. George』s University of London, London, UK

書籍：疫苗佐劑的研究與質量控制

第五節：佐劑的安全性評價

一、佐劑的非臨床研究

佐劑的臨床研究除了關注其免疫增強作用外，還應十分關注其不良反應，應從以下幾個方面進行考慮：

（一）佐劑對抗原免疫原性的作用

佐劑對抗原免疫原型是佐劑應用的基礎，必須有充分的動物模型證據表明佐劑的使用真正能夠誘發和加強機體產生長期、高效的特異性免疫反應，從而提高機體的保護力。免疫效果應包括體液免疫和細胞免疫兩個方面、觀察機體抗體的產生情況和持續時間。理想情況下，應該使用相關的動物模型證明其對病原物生物致死性攻擊的防禦效果，如果不存在這樣的模型，應選擇能誘導產生與人體免疫應答特性相似的動物模型。

（二）葯代動力學

新的佐劑在與抗原進行混合使用以前應單獨給葯進行人體葯代動力學研究，以取得科學的、令人信服的結果。佐劑與疫苗混合後，除了進行理化分析觀察其結合、解離、相互作用的情況外，還應進行臨床分析取得更直觀的科學數據，以對佐劑效果做進一步分析。

（三）佐劑及佐劑/抗原結合物的毒性

應對佐劑及佐劑/抗原結合物分別進行試驗，以檢查佐劑及佐劑/抗原結合物的毒性。在臨床前安全評價中多使用小鼠作為動物模型，但不同動物品系的小鼠，甚至一個種內的不同株，對同一佐劑都可能顯示不同反應。建議使用至少兩種以上小鼠（最好使用已經進行過佐劑活性研究的動物），載輔以家兔或豚鼠進行動物實驗。疫苗和佐劑單獨使用或二者混合使用時，其濃度應模擬或大於人體使用劑量。佐劑及佐劑/抗原結合物的毒理學分析主要考慮接種部位的病理反應、局部耐受性、致超敏作用、過敏反應、對組織和器官的全身毒性、免疫抑制作用、致癌性，遺傳毒性、生殖毒性、基因毒性、組織吸收和器官排除、重複劑量毒性等。可參照疫苗不良反應的觀察方法觀察研究佐劑的不良反應。

二、佐劑的臨床研究

臨床研究要能證明疫苗中佐劑的使用可增強針對抗原的免疫應答，使免疫應答達到預期的效果，同時不會明顯增加局部和全身不良反應，以提高疫苗的安全性。應保證佐劑的使用在增強免疫應答中取得的潛在利益要超過可能帶來的風險。

（一）佐劑免疫作用研究

早期的臨床研究主要在健康成人以及較少例數的特定目標人群中進行。如果疫苗計劃在全部人群或主要在嬰幼兒/兒童/老年人使用，則應該在健康成人研究後，儘可能在一定數量的目標人群中進行觀察。確證性的臨床試驗則儘可能在目標人群中進行，如果年齡組跨度較大，應事先分層或進行一個以上臨床試驗。不論抗原是否已經批准上市，都應包含單獨抗原與抗原加佐劑的對比研究，以證實加入佐劑的必要性。對於新佐劑和新抗原混合時，還應採用預防同樣疾病的上市疫苗作為對照。免疫應答的特徵應包括成品中抗原的單獨使用以及抗原/佐劑結合物接種時的免疫應答的比較。應對佐劑本身可能存在的潛在影響進行綜合評價。可能的話，還應對體液免疫和細胞免疫情況進行評價。

（二）佐劑劑量研究

尋找合適的佐劑劑量以及佐劑與抗原的合適比例，以期取得免疫應答和不良反應之間權衡的最佳效果。對於新佐劑和已上市的抗原結合物，抗原劑量的選擇可以參考已上市同類產品的用量，重點考慮佐劑的使用劑量；而對於新佐劑和新抗原而言，既要考慮佐劑的劑量，同時應考慮抗原的劑量。

劑量研究應儘可能在疫苗的目標人群中進行。當劑量探索研究未能選擇出合適的抗原/佐劑劑量時，就不得不用驗證試驗評價一種以上製品。

（三）觀察指標及免疫測試方法的選擇

由於尚不清楚新佐劑在機體中對抗原免疫應答的性質產生何種影響，因此應同時關注體液免疫和細胞免疫兩個方面的作用。在體液免疫方面，除了用ELISA檢測抗體外，如可能，還應檢測中和抗體、殺噬菌體抗體或殺菌抗體，應對免疫球蛋白的亞類進行分析研究；在細胞免疫方面，應檢測抗原特異性T細胞反應，包括Th1、Th2和T調節因子細胞和細胞因子；當然最精確最有說服力的實驗是保護攻擊實驗。

下期幻燈共享，敬請關注！

Nonclinical aspects of vaccine development

本文來源：基於網路信息綜合編輯，如有異議可隨時聯繫我們。

本期編輯：hantavirus

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