單細胞測序知多少？

和普通的測序比起來，單細胞測序給人的印象就是三高——高逼格，高門檻，高分文章。那麼它究竟是如何成為測序技術中的三高的呢？

首先說說什麼是單細胞測序（Single-cell sequencing）。普通測序所提取的RNA（或DNA）源於樣本中的多個細胞，所以普通測序的結果不可避免的會受到不同細胞間異質性（Heterogeneity）的影響，而單細胞測序則是針對單個細胞的基因組進行測序，能夠更好地幫助我們認識細胞與細胞之間的差異。

肯定有童鞋要問了，一個細胞里的DNA或RNA僅僅處在皮克（Picograms）級的水平，這麼少的量遠遠達不到現有測序儀的最低上樣需求，那麼單細胞測序要怎麼搞？這就不得不提到全基因組擴增（Whole-genome amplification，WGA）這項技術了，這項技術顧名思義，就是對全基因組進行擴增，目前主流上有三類方法（見下圖）。

PCR為基礎的擴增方法，在擴增的時候對一些特殊位點可能會存在偏好，導致對整個基因組的覆蓋程度不夠。

以MDA（Multiple displacement amplification）為代表的等溫法雖然對基因組的覆蓋程度較好，但是一致性（Uniformity）較差。

而以謝曉亮（Sunney Xie）教授研發的多重退火和成環循環擴增技術（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）為代表的混合法，在基因組的覆蓋程度和一致性上相比於前兩種方法處於中等。

從全基因組擴增這一步來看，擴增帶來的誤差會對全基因組測序的精度造成極大的影響。而實際上單細胞測序技術上的挑戰遠遠不僅於此。從第一步細胞分離開始，就需要極高的實驗操作水準，特別是在面對複雜的固狀組織時，標準的protocol固然能幫上很大的忙，但是細緻的操作和實操經驗更為重要。而擴增之後，在基因組中如何選定合適的研究範圍對於降低成本和提高效率至關重要。

正是由於單細胞測序所要面臨的重重困難，在2013年以前，單細胞測序技術在全世界範圍內只有極少數頂尖的實驗室才有應用。2013年的時候，Fluidigm公司推出了世界上第一款單細胞RNA測序自動化準備系統（Single-cell automated prep system for RNA-seq），這一技術上的突破使得單細胞測序變得足夠簡單，成本也降低了很多，這才使得單細胞測序能夠普及開來。同年，單細胞測序技術榮膺Nature Methods的年度技術。所以說，單細胞測序技術雖難，但是童鞋們現在上車並不算晚，車才剛開沒一會。

下面說說我們到底為什麼要做單細胞測序，單細胞測序到底有哪些應用？

前面已經提到，同一組織中的細胞間都是存在異質性的，更不必提不同組織、不同系統中細胞的異質性了。這一異質性，會影響我們對細胞基因功能認知的準確性。單細胞測序能夠幫助我們了解那些難以培養的微生物的基因組功能、了解遺傳鑲嵌功能（Genetic mosaicism）在普通生物學功能或是疾病發生中的作用、了解腫瘤內在異質性對腫瘤發展以及耐藥性的影響、重新定義細胞亞型等等。

左為在單細胞生物中的應用，單細胞測序可以幫助我們搜尋稀有（基因組）微生物；右為在多細胞生物中的應用 ，單細胞測序可以幫助我們尋找罕見突變，從而了解基因突變和進化的信息和其對應的生物學功能。

最後再給大家分享兩個具體的單細胞測序的應用實例：

1、Single-CellResolutionofTemporalGeneExpressionduringHeartDevelopment （Dev Cell. 2016 Nov 21）

在子宮內，心臟最開始是一根管，然後是芽珠狀的硬塊，再通過自動摺疊，最終變成了我們熟知的四腔結構，那麼究竟細胞是如何一步一步進行上述程序化的操作的呢？

心臟結構形成過程

該文作者從小鼠胚胎髮育的七個不同階段提取心臟細胞樣本，他們將細胞分為三類已知的細胞——心肌細胞、內皮細胞和成纖維細胞，並觀察它們的基因活性隨時間是如何變化的；他們在小鼠模型中闡明了Nkx2.5雜合突變是如何導致先天性心臟缺陷的。心臟細胞發育圖譜的構建有助於我們了解基因和細胞的變化是如何導致心臟結構的變化的、基因突變是如何改變每一個細胞群成熟的方式以及心臟構建過程中的重要步驟是什麼。

2、Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq （Science. 2017 Mar 31）

星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤都被認為是不治之症，但手術和放療可明顯延長生存期。這兩種腫瘤被認為是由支持和保護神經元的神經膠質細胞的亞型發育而來的，但在遺傳學、外觀和基因表達方面都有所不同。雖然這兩種類型的腫瘤都含有類似的神經膠質細胞，它們也都含有該細胞類型的標記，這就引起了人們對它們起源於不同類型細胞這一普遍看法的質疑。

實驗流程

該文研究團隊對10例星形膠質瘤樣本中的9800個細胞和6例少突膠質瘤樣本中的4300個細胞進行了單細胞RNA測序。再結合癌症基因組Atlas中的165例轉錄組數據，研究人員發現，兩種腫瘤都含有3種癌症細胞：非增殖性細胞、類神經幹細胞和祖細胞。其中的非增殖細胞被細分為星形膠質細胞樣和少突膠質細胞樣，利用單細胞測序技術，作者闡明了這兩種細胞具有相同的起源，其不同之處主要是遺傳學差異，以及腫瘤微環境（如特異性免疫細胞丰度等）組成不同。

在該研究中，作者觀察到即使在更晚期的腫瘤階段，越是分化的腫瘤細胞越不容易增殖，這意味著，如果可以促進腫瘤細胞分型，將會顯著地控制腫瘤生長。故而作者提出可以使用免疫療法攻擊特定的細胞類型，從而終止腫瘤的生長的治療策略。

好了，今天就扯到這裡了！

小張憑藉多年單身經驗，幫助大家解決各種單細胞測序問題

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