Adevax很有前途的抗癌疫苗佐劑

EBioMedicine. 2017 Feb; 15: 127–136.

Advax, a Delta Inulin Microparticle,Potentiates In-built Adjuvant Property of Co-administered Vaccines

標題：Advax，一種delta菊糖微粒，增強聯合使用疫苗的內在輔佐屬性

摘要：Advax是一種由delta菊糖衍生的微粒，已被開發作為幾種疫苗的佐劑。然而，它的免疫學特性和潛在的作用機制尚未被闡明。在此，我們展示了Advax當與流感分裂疫苗結合時，表現為一種2型佐劑，一種T細胞輔助(Th)2型抗原，但當與流感滅活的全病毒(WV)結合時，作為一種1型佐劑，一種Th1型抗原。此外，當advax-佐劑的WV疫苗被用於免疫toll樣受體(TLR)7敲除小鼠的免疫應答時，沒有觀察到佐劑的作用。這些小鼠無法對WV抗原中含有的RNA進行應答。同樣地，當Advax與無內毒素的卵清蛋白結合時，沒有任何輔助作用，卵清蛋白是一種中性的抗原。在腫瘤壞死因子(TNF)-敲除小鼠中，也沒有發現輔助作用，其輔助作用則需要樹突細胞(DCs)和吞噬性巨噬細胞的存在。因此，與其他佐劑不同的是，Advax可以增強聯合管理抗原的內在或固有的輔助特性。因此，Advax是一種獨特的佐劑，它可以通過一種尚未確定的機制來增強疫苗抗原的內在佐劑特性。

引言：

佐劑在啟動、最大化和延長免疫原性方面發揮了關鍵作用，因此在許多疫苗中發揮了功效。在過去90年的大部分時間裡，鋁鹽(明礬)是唯一常規使用的人類佐劑。最近，有限的附加輔助配方，包括角鯊烯油乳劑，以及明礬和單磷酸酯的結合，已經獲得許可用於人類。理想的疫苗應根據理想的疫苗特性選擇合適的佐劑，包括與病原體保護相關的最佳免疫應答類型。不幸的是，目前被批准用於人類使用的佐劑的缺乏限制了對疫苗免疫應答進行微調的能力，這就使得迫切需要開發不同類型的佐劑。

病原體識別受體(PRRs)，如Toll樣受體(TLR)，Nod樣受體(NLRs)，或靶向佐劑導致炎性細胞因子的炎症性受體，和I型干擾素(IFN)的產生和抗原呈遞細胞(APCs)的協調刺激分子的上調。

與病原體相關的分子模式(PAMPs)，如微生物核酸、糖脂或蛋白質在疫苗中起著內源性的內置佐劑，觸發先天免疫應答，從而形成一種由特定抗原誘導的適應性免疫應答。例如，流感WV疫苗的病毒RNA激活TLR7，從而導致對流感滅活的全病毒(WV)抗原的一種偏離應答。

Advax是一種微粒多糖，它的微粒是由多果糖-呋喃葡萄糖(delta inulin)的微粒衍生而來的。它已經被證明可以改善各種疫苗的免疫原性和有效性包括抗流感、乙型肝炎、日本腦炎、西尼羅病毒、人類免疫缺陷病毒、炭疽菌、李斯特菌。在人類臨床試驗中，疫苗包含Advax已經在人類包括乙肝、流感和蟲刺過敏臨床試驗中進行了評估。儘管這些臨床試驗證明了Advax佐劑出眾的免疫原性和良好的可耐受性，但它的作用機制仍然未知。

在本研究中，我們研究了Advax對各種不同的疫苗抗原的輔助作用。出乎意料的是，Advax和明礬和TLR激動劑不同，並沒有對聯合抗原的免疫應答產生偏離。相反，有趣的是，Advax增強了疫苗抗原本身的免疫偏差，這表明，Advax是一種內在的抗原本身佐劑活性的放大器。

為了進一步探索Advax的作用模式，在體外和活體中檢驗了Advax自身的生物學特性。這些數據表明吞噬型巨噬細胞是Advax和腫瘤壞死因子(TNF) -α信號通路的調節劑之一，對輔助活性很重要。

3結果：

3.1.與Th2型抗原結合的情況下，Advax佐劑增強了Th2的應答

以了解Advax的輔助作用，我們最初研究了Advax+流感裂解疫苗(SV)的免疫接種小鼠免疫應答，SV一種之前提到的抗原，可以引起Th2免疫應答。SV免疫單獨產生IgG1的生產(一種Th2型IgG的子類)和高免疫劑量誘導IL-13 (Th2型細胞因子)生產，是一種Th2誘導抗原。增加Advax到SV增強了IgG1抗體產生而沒有增強IgG2c抗體的產生，在較低的(0.015和0.15 g)抗原劑量下出現明顯增強，但在較高的抗原劑量中沒有觀察到。

明礬，一種常見的用於人類免疫的Th2型佐劑也在低抗原(0.15 g)劑量下增強了IgG1的主要抗體應答。因此，Advax，類似於明礬，誘導了Th2對SV抗原的應答。明礬也被認為會引起IgE的產生，可能會增加疫苗過敏的風險。因此，在SV使用Advax或明礬免疫接種後IgE血清水平被檢測。儘管明礬明顯增加了IgE的生產以劑量依賴方式，但Advax並沒有引起IgE的生產，只會放大由SV引起的抗體類型應答。檢查T細胞的應答是通過刺激免疫小鼠的脾細胞，使用來自流感病毒核蛋白的主要組織相容性複合物MHC I(CD8 T細胞)或MHC II (CD4 T細胞)肽。有趣的是，Advax增強IgG1子類抗體生產的影響，與CD4 T細胞IL-13產量的增加沒有關係，這明顯不同於SV單獨使用的參照小鼠。相反，使用明礬佐劑明顯增加了CD4 T細胞的IL-13產量。這些結果表明，當Advax與SV結合時增強了Th2型抗體應答，與明礬不同，與增加的IL-13或IgE沒有關係。

3.2.與一種Th1型抗原結合，Advax佐劑可增強Th1應答

我們檢查了使用滅活全病毒流感疫苗(WV)+Advax或明礬的小鼠免疫應答。WV抗原包含病毒RNA，引發TLR7激活，從而作為一種內源性佐劑，誘導Th1應答。當與WV結合時，Advax佐劑只會增強IgG2c(Th1類型的子類)的生產，對IgG1的生產影響很小，而明礬則抑制了由WV引起的IgG2c應答，並明顯增加了IgG1水平。在細胞因子水平上，與單獨使用WV免疫的小鼠相比，WV與Advax聯合增強了干擾素IFN-γ(Th1型細胞因子)生產，通過抗原刺激的CD4和CD8 T細胞。與之相反的是，用明礬抑制了IFN-γ的生產，同時明顯地增加了CD4 T細胞的IL-13產量。這些結果表明，Advax在與SV結合時，作為Th2佐劑，但與WV結合時，它是一種Th1佐劑。相比之下，明礬對SV和WV抗原都是一種Th2型佐劑。

3.3.在疫苗抗原中Advax的輔助作用是由內源性佐劑所塑造

3.4.Advax佐劑在體內激活樹突狀細胞，而不是在體外

由於Advax的輔助作用是由聯合接種的疫苗抗原決定的，在體外和體內都檢測了Advax自身的基本生物學效應。由於樹突狀細胞(DCs)在佐劑誘導免疫應答中起著核心作用，我們首先研究了Advax在體外和體內活化DCs的能力。對小鼠骨髓的DC細胞，在體外進行了15小時的Advax，明礬或脂多糖（LPS）刺激實驗，並通過流式細胞術對CD40（DC活化標誌物）的表達進行評估。然而，如預期的LPS在體外增加pDCs和cDCs的CD40表達，無論是Advax，還是明礬，都不會影響到DC的CD40表達。

接下來，我們研究Advax或明礬激活DC CD40表達，局部輔助治療後，在染色淋巴結測量DC細胞CD40表達。與體外發現不同的是，在體內注射時，Advax和明礬都增加了染色淋巴結中活化的pDCs的頻率。值得注意的是，在我們用這種評估方法測試的所有佐劑中沒有觀察到CD8a+DCs和CD8a- DCs的佐劑依賴性激活。佐劑對所有的DC (pDC、CD8α+ DCs和CD8α?DCs)表達CD86的影響類似於CD40表達的影響。這些結果表明，Advax在體內活化樹突狀細胞是一種迄今為止尚未被發現的機制，而這種機制並不是直接影響DC本身如同體外缺乏效應所示。

明礬誘導的DC體內激活，但不是在體外，明礬的作用可能會被解釋為在注射部位導致細胞死亡，從而導致細胞外DNA的釋放，然後激活DCs的DAMP受體。因此，我們想知道Advax是否會在注射部位引起細胞死亡，從而間接地通過DAMP受體激活DCs。為了驗證這種可能性，在體內進行了對Advax或明礬的注射位點的細胞毒性和宿主DNA/RNA釋放的進行評估。在腹腔內(i.p.)注射或明礬後，收集了腹膜洗液，並測量了這些液體中死亡細胞的數量和DNA/RNA濃度。雖然明礬誘導細胞死亡和核酸釋放，但注入的Advax不會導致細胞毒性或核酸釋放，這表明體內DAMP信號通路與Advax誘導DC激活和CD40或CD86表達能力無關。

3.5.吞噬性巨噬細胞是Advax佐劑效應的細胞調節因子

雖然滅活流感病毒的免疫複合物被標誌為CD169 +(也稱為Siglec-1或MOMA-1)巨噬細胞在染色淋巴結(DLNs)誘導體液免疫應答,有些顆粒佐劑有效被MARCO+巨噬細胞所攝取。因此，利用熒游標記的Advax粒子對DLN中的Advax的作用進行了分析。在皮內(i.d)注射一小時後，一個弱的Advax信號在DLN的MARCO+巨噬細胞一起局部化，這一聯合定位信號在隨後的24小時後要高得多。在DLN中，幾乎沒有任何Advax與CD169+巨噬細胞的聯合定位被觀察到，這表明，注射的Advax是被MARCO+巨噬細胞所攝取。

接下來，為了研究被攝取到巨噬細胞里Advax佐劑起效的必要條件，我們利用了巨噬細胞和DCs的不同恢復動力學，注射磷酸鹽脂質體並對其進行了跟蹤。這將在第2天完全耗盡所有的巨噬細胞和DCs，但隨後，巨噬細胞在至少7天內無法恢復，而在這段時間裡，樹突細胞大多恢復了。有趣的是，隨著磷酸鹽脂質體治療Advax的佐劑效果明顯降低了，無論檢測時間點(第2天或第7天)，表明Advax佐劑效應是依賴於巨噬細胞的存在。

3.6.Advax改變了IL-1β,c型凝集素受體的基因表達和與TNF-α相關的信號通路

以了解Advax的生物學特性，並對其對細胞因子生產的影響進行了研究。明礬誘導了各種細胞因子的產生，包括白細胞(IL)-5、IL-10、IL-12、TNF-α,粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，而Advax只有在一些非常有限的細胞因子存在應答，包括IL-10、G-CSF和巨噬細胞炎症蛋白(MIP)-1被觀察到。為了進一步探索Advax在體內的主導的生物學效應，在局部(i.d)或系統性(i.p)的Advax的治療後，在組織中對基因表達譜進行了檢查。Advax政府通過i.d.路徑引起有限的基因表達改變，而i.p.辦法改變了幾個組織的基因表達。Advax通過i.p.路經的治療，導致肝和脾在注射後6個小時的不同基因表達與急性期應答、炎症、趨化因子、補體/血小板和c型凝集素受體(CLRs)相關的應答有關。此外，對受調控不同基因的細胞數量的分析表明，體內Advax激活了由中性粒細胞和巨噬細胞表達的基因。此外，IPA的上游調節因子分析中，提出了4個上游調節因子: NF-κB (複合體),IL-1β, IFN-γ,和TNF-α均受到了i.p.治療Advax的影響。這反過來驅動增強巨噬細胞粘附、嗜中性化和造血和自然殺傷細胞的基因表達。鑒於這些基因短時間框架效應，以及Advax菊糖粒子的組織居留性質，這些基因對肝臟和脾臟的影響可能是由腹外Advax刺激細胞釋放的可溶性信號所間接引起的。

為了確定與Advax佐劑效應相關的信號通路，我們研究了這些生物因子對佐劑的作用。我們首先研究了Advax對IL-1β產量的影響。腹腔巨噬細胞或顆粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導的骨髓衍生樹突細胞(GM-DCs)用Advax或明礬進行刺激，然後對IL-1β產物進行檢查。然而體外Advax刺激細胞沒有檢測到IL-1β生產,而明礬明顯誘導IL-1β生產。因為一些微粒佐劑需要NLRP3炎性因子激活和隨後因佐劑生產IL-1β,Advax佐劑效應在缺失NLPR3炎性因子組件,NLRP3,Caspase1或IL-1r在使用基因敲除小鼠體內進行檢測。Advax在這些NLPR3炎性因子缺陷的小鼠中起了明顯的佐劑效應，表明了Advax的佐劑效應是獨立於NLPR3炎性因子/ IL-1β信號途徑的。

3.7.TNF-α對Advax佐劑效應是必須的

基因表達分析表明Advax影響TNF-α相關的信號通路。因此，我們研究了Advax產生TNF-α生產的能力。巨噬細胞被Advax體外刺激，並在培養基中被檢測TNF-α。Advax沒有誘導TNF-α生產，而在體外明礬的刺激下明顯巨噬細胞TNF-α生產。然而，i.p.注射Advax的結果確實導致了明顯增加的血清TNF-α水平，而矛盾的是，i.p.明礬注射並沒有影響血清TNF-α水平。因為i.p.注射Advax影響基因表達在肺和脾等遠程組織中包括TNF-α信號通路相關的基因，這表明血清中的TNF-α可能來自於這些組織。最後，為了檢驗TNF-α在Advax的佐劑效應，Tnfa-/-小鼠免疫接種了Advax-佐劑WV或乙肝表面抗原，並對其產生的抗體應答進行了檢查。TNF-α的缺乏明顯降低了對抗體應答的佐劑效應，這表明，完整的TNF-α信號對抗體應答的佐劑效應是很重要的。

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