這些樣本凍存和復甦的坑，怎麼破？

小葵最初做實驗的時候，往往看個大概就開始操作了，常常以為自己都會了，但經常掉坑裡。想少走彎路，就要深諳其中門道，避開前人所遇到的陷阱。今天小葵就來講講自己親身經歷的那些不堪回首的過往，希望大家引以為戒。

1

復甦時遇到凍存時挖的坑

實驗室偶爾也會發生這樣的情況：「靠，細胞要死了，趕緊凍掉，不能讓細胞死在我手裡。」「天呢，細胞培養液都這麼黃了，趕緊凍掉。」「媽呀，細胞融合度都逼近100%了，趕緊凍掉。」「咦，細胞好像少了點，算了，就這樣吧。」如果你復甦的細胞就是上面這些人所留下來的，那就要格外注意了。

解決方法：

所謂知己知彼才能百戰不殆，在復甦前，一定要先清楚地了解這份細胞的增殖能力。如果增殖能力不高，接種時就要增加細胞接種密度並添加5%~10%的血清。如果細胞本身數量就非常少，也可以不離心，直接接種培養（加入培養基的體積＞5倍的凍存細胞體積）。復甦後3天內盡量少對細胞進行操作，延遲換液時間。

2

無孔不入的微生物

做實驗就像走鋼絲，稍不留神就會跌進充滿微生物的沼澤中不能自拔。

解決辦法：

凍存時，一定要擰緊凍存管的蓋子，否則水浴復甦的時候，水浴鍋中的水就會滲入到凍存管中去，造成細胞的污染並會使那些低免疫力的接受移植的患者產生嚴重的感染。

推薦幾款最新的細胞乾式復甦的儀器給大家，可以避免傳統人工水浴方法的污染風險並且在復甦的整個過程中可對數據進行追蹤。

適用於凍存袋

適用於凍存管

3

細胞非正常「復甦」

那是一個安靜的下午，大家都在專心地做著實驗，突然聽到有人大叫「這是誰的細胞，一直放在外面，都化了。」原來剛才同事取細胞的時候，把整個凍存架都拿了出來，後來居然忘記再把它放回液氮罐中。而此時細胞們已經無一倖免地 「融化了」。

解決辦法：

馬上種瓶，千萬不要把這些細胞繼續放回液氮罐中凍存。此時細胞內已經有大量的冰晶形成，細胞膜已經受到損傷，如果離心就會造成細胞膜完全破碎、細胞立即死亡的後果。所以切記不要離心，而應直接種瓶，也不要進行吹打，只輕輕搖晃。培養時加入10%的血清，種瓶後48h內都不要對細胞進行操作。這是一個真實的案例，後來在大家的努力下，那些增殖能力本來就旺盛的細胞還是活了下來。

備註：本辦法也同樣適用於那些停電後造成超低溫冰箱升溫（一般升溫到-40℃時就要小心了）的情況。

4

拿錯了細胞，養了別人家的「孩子」

電視劇里抱錯孩子的狗血劇情也同樣會發生在實驗室中。學校的液氮罐基本上都是公用的，所以如果樣本標記不詳就會發生拿錯的情況。

解決辦法：

每支凍存管上都應用凍存專用的記號筆詳細標記上細胞名稱、凍存時間、樣本批號等信息並將這些信息詳細記錄在冊。存放細胞時，最好規定每個人的存放位置，免得下次找細胞的時候非要把整個液氮罐翻個底朝天才找得到。復甦拿取細胞時，也應在對應的存放位置處進行查找，找到對應的細胞後應核查記錄冊上的信息是否與凍存管上的細胞名稱、凍存時間、樣本批號一致。

5

安全第一，細胞第二

凡是和液氮接觸的操作，都應該注意安全。小編的同事Z就在一次打開液氮罐蓋子的時候被氣體衝擊了眼睛，導致眼睛當場流血，不過後來經過醫治已經沒有什麼大礙了。還有小編的同事L在前單位工作時有一次在樣本保存室里突然暈倒了（估計是液氮罐漏氣所致）。

解決辦法：

操作人員在接觸液氮罐時應戴防護面罩、防護手套，穿防護衣，防止凍存管或氣體爆裂對人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應裝有檢測氣體濃度的報警裝置，防止人員暈厥的現象發生。大家在做實驗的時候一定要小心操作、注意安全。

6

如何讓凍存的組織滿血復活

很多時候我們都會遇到組織復甦培養的成功率低、長勢慢的情況，這到底是哪裡出錯了呢？

解決辦法：

（1）組織要剪得足夠小；

（2）程序降溫盒不要立馬放入-80℃冰箱中，應先置於4℃冰箱內15min~30min；

（3）凍存液的體積應至少是組織體積的2~3倍；

（4）組織復甦後進行培養時，應在培養基中加入5%～10%的血清。

7

復甦後，細胞不見起色就扔掉？！

復甦2~3天後，認為細胞沒有明顯增殖就扔掉細胞，但其實有些細胞需要復甦一周後才會發生明顯的變化。

解決辦法：

如果復甦培養3天後細胞仍不見增殖，先不要著急換液。試著補加血清、細胞因子，等一周後再看細胞增殖情況再定。

8

心急凍不了好細胞

凍存時，不要將細胞放入剛剛從-80℃冰箱中取出的程序降溫盒內（此時盒內的異丙醇還是凍住的）。這樣會導致細胞在一開始的時候就進入低溫狀態，影響細胞復甦後的存活率。

解決辦法：

將程序降溫盒提前拿至室溫中，使細胞可以從室溫降至-80℃。

常規的程序降溫盒中是填充了異丙醇的，所以能夠以每分鐘一度的速度進行降溫。但是異丙醇屬於有毒溶劑，又容易揮發，長期使用不但會對環境造成污染也對實驗人員的安全有不利影響。推薦一款新的細胞程序降溫盒，不需要填充異丙醇就可以正常工作，而且很容易打開蓋子，方便拿取。

新型程序降溫盒

其他注意細節：

1、剛剛復甦的細胞就像剛剛出生的小BABY一樣脆弱。一切接觸細胞的動作都要儘可能地輕柔。

2、低速離心，離心力不超過300g。

3、除了極少數細胞對DMSO過敏外，大部分的細胞都不需要去除DMSO。細胞復甦後可直接接種，第二天進行換液即可。

4、配置好的凍存液在4℃冰箱內可以暫存1周，在-20℃冰箱內可以保存一個月。不過最好還是現配現用、不要反覆凍融。

5、 DMSO存在一定的毒性，配置凍存液時一定要戴好手套。

6、 復甦時使用的培養基最好與凍存前使用的培養基一致。

7、 取凍存盒的時候一定要謹防凍傷，不要把你的小鮮肉「粘」到凍存盒上面。

8、復甦第二天看一下細胞，如果細胞狀態不行可以補加一下血清、因子。

附：

表1生物樣本及樣本提取物常用保存方式比較

圖片來源於eBiobank

表2.生物標本的特定生物標誌物穩定性與貯存溫度/持續時間的關係

(穩定性符號為：M，多個結果；N，不穩定；S，穩定。)

圖片來源於eBiobank

合作微信：helixlife6

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