血栓學檢驗臨床應用中的幾個問題及其理解

健康 07-07

血栓學檢驗臨床應用中的幾個問題及其理解

伴隨著人們生活水平的提高，心血管疾病發病率和病死率也成逐年增高的趨勢，血栓栓塞性疾病做為多種系統疾病的併發症成為臨床醫學的研究重點。近年來，血栓止血學在出血性疾病的診斷、術前檢查和抗凝治療檢測中得到了廣泛應用。受益於的迅猛發展，自動化凝血儀的普及大大提高了檢測效率，降低了系統誤差，使檢測結果的精密度和準確度達到前所未有的水平。然而，當前國內血栓學常規檢驗中仍然存在著一些誤區，除了方法學本身的問題之外，缺乏對項目和檢測原理的理解，也是造成目前參數使用不當、難以向臨床提供有力支持的主要原因。本文圍繞血栓學檢驗標準化內容從三個方面加以討論。

一、凝血檢驗的校準化與可比性

從PT和APTT檢測方法建立以來，相關學者就一直致力於這兩個參數的標準化，迄今為止，只有PT實現了部分標準化，也就是抗凝治療監測中INR系統的應用；而APTT的標準化仍然停留在探索階段。

（一）抗凝治療監測中PT的標準化

由於凝血活酶試劑活性的差異以及報告方式的不同，抗凝治療的患者在不同實驗室得到的PT往往不具有可比性，不能用於抗凝治療藥物的調整。為此，1977年世界衛生組織將人腦來源的凝血活酶作為一級國際參考品（IRP）來校準凝血活酶試劑。並將PT以INR的形式表示，INR=（PT/MNPT）ISI，其中ISI為凝血活酶的國際敏感度指數，MNPT為正常人凝血酶原時間的幾何均數，這種校準方式大幅提高了手工檢測時不同試劑之間的檢測標準化。

（二）自動化凝血儀的多樣性使報告標準化再次面臨困境

INR的方式提高了實驗室的有效性和口服抗凝治療的安全性，在各大臨床指南中都可以發現以INR為監測目標的診治措施。今天，我們必須明確的是INR概念和校準方式的提出是基於手工方法的，當自動化凝血儀被普及使用之後，INR概念的內涵發生了更為複雜的改變。測試原理與手工法顯著不同，對凝血活酶ISI以至INR產生較大的影響而且程度不確定，機械和終點判定等因素破壞了INR體系原有的可靠性和精密度。據文獻報道，同一廠家的相同機型對INR的影響都有顯著差異，儀器校正顯得十分必要。

必須明確：INR是WHO利用IRP標定凝血活酶試劑後，手工測定PT時優化報告的一種方法和理念，這時可以減少室間差異及提高報告的可比性。凝血活酶校準時要求使用參考品和試管傾斜方法判定結果，然而，將商品化凝血活酶在自動化凝血儀上檢測標本時，原理髮生了改變，這種校準方法的基礎已經不復存在了。這時我們校準的不僅僅是凝血活酶，而是包括凝血活酶和檢測技術（儀器）在內的整個系統。

如果不用標準血漿校準，數據顯示實驗室間的INR差異具有顯著性，波動幅度（CV%）大約為9～17%，僅60%的實驗室在10%以內。即便使用同種試劑，同類型儀器測定的INR也有較大差異。原因之一就是很多研究誤以為ISI只針對試劑，實際上，一個固定的ISI未必適合所有機型，如果不考慮儀器差異而泛泛考察可比性，將導致試劑校準和系統校準的混淆。自動化凝血儀的檢測系統往往包括幾個部分：正常血漿、抗凝患者血漿、凝血活酶試劑、檢測技術（手工法和不同類型的凝血儀）。試劑對標本類型差異會產生不同反應，比如，某試劑在自動化凝血儀上與IRP手工法對比測定正常和高值兩組標本時，可能回歸曲線的斜率很接近，但是截距有差異，也就是試劑相關性較好，但是在不同值段的測定結果有差異。臨床實踐中不可能對正常和抗凝患者的標本建立兩條工作曲線，所以應盡量選擇性能表現均一的試劑。

（三）要嚴格限定試劑ISI的適用範圍

為了避免混亂，通過多年研究和專家的倡導，國外製造商已經在其說明書中提供儀器型號特異的凝血活酶ISI，便於用戶使用；但是要提供所有儀器和不同試劑組合的ISI顯然是不可能的。更讓人頭疼的是，製造商為每一批凝血活酶試劑提供的ISI不一定很準確，定標血漿使用不當進而導致INR的校準偏差。

凝血活酶製品校準的準確性取決於口服華法令患者標本的數量，WHO推薦的用IRP校準凝血活酶試劑的方法需要測定至少20份新鮮正常血和60份新鮮抗凝治療的血樣。許多廠家難於收集到足夠數量的標本，無法得到準確的ISI，受害的不單是實驗室，更多的是患者的利益。

是否選用同物種的IRP來校準凝血活酶，也是ISI標註的關鍵，人源和兔源IRP校準的凝血活酶在檢測性能上是不同的。1977年以後WHO陸續改良更新了幾個物種和不同級別的凝血活酶參考品，雖然WHO生物標準化專家委員會提出所有商品化凝血活酶都應以同一物種的國際參考品校準，甚至有專家認為應該都以人腦參考品校準，以減少物種之間的差異，但是據筆者觀察，多數產品說明書中都沒有校準方法的詳細表述，這就為單純追求低成本而不加選擇地換用試劑埋下了隱患。

此外還有生物參考範圍不同的問題。理論上，使用系統特異的ISI計算的INR應該是相當接近的，然而，由於校準方式不當和生物多樣性的存在，INR的值也有出入，比如各實驗室MNPT不同，凝血活酶生產商標定自己產品ISI時使用的方法不同等。

這些不利因素就對凝血實驗室提出了較高要求，但是自行校準也缺乏可行性。醫院測定MNPT還相對容易，但是按照WHO的推薦方法對凝血儀和試劑組成的系統來校準ISI並非易事。多數實驗室直接使用了試劑標註的ISI，甚至有的ISI不是針對自己的機型。而且即便是校準了ISI，也只能出來報告之後再編輯程序批量計算校準後的INR。據筆者了解，目前在國內主流機型上通過調整ISI實現系統校準難度較大。因此，要麼在實驗室信息系統（LIS）中增加數據處理的程序語句，要麼計算INR後再手工輸入，這種方式推行起來有困難。

（四）止凝血檢驗中的校準和定標辨析

先是校準試劑，接著又校準試劑和儀器所組合成的系統，但是，我們仍然沒有全面考慮到包括測試環境的所有因素。比如說粘度法中磁珠的差異，離心比濁法儀器中離心力的差異，光學比濁中的光徑，凝集曲線的特異性，電子和機械部件上差異等等，不一而足，任何因素不一致都會使結果受到影響。任何一種方法的結果都是根據定標曲線和檢測信號確定的，儀器之間不僅信號不同，定標曲線更是千差萬別。儘管常規工作中的定標通常表述為Calibration，但是這並不是嚴格意義的校準。定標曲線的建立是為了在本實驗室環境下保持檢測體系穩定的一種方式，只是一個檢測平台，用於保證實驗室對某一人群標本測定的一致性。這個過程中沒有真正的標準品出現，如果定標血漿未經IRP校準，那麼該定標是不能溯源的，定標後的不同儀器未必具有可比性，系統差異的存在也不能通過定標來消除。由於儀器性能上的差異性，簡單地用校正因子來調整檢測系統的方法是無效的。

APTT的標準化進程更為困難。檢測系統類型、接觸活化因子以及試劑磷脂成份的差異會導致APTT反應的差異。1995年國際上提議建立APTT標準化的校準模型，而目前還沒有適用於APTT的國際標準品，1998年Van Den Besselaar教授提出可以將含有合成磷脂和膠質硅的凍干APTT試劑作為候選的APTT國際標準品。Clauss法Fib定量的定標曲線可以溯源到參比血漿，因此這種方法可以實現標準化, 而PT衍生法是根據濁度變化換算結果，不僅與真實濃度存在偏差而且也不能標準化。

（五）實現止凝血檢驗標準化過程中的有益嘗試

可以說，凝血檢驗的標準化仍然在不斷完善的過程中，一方面我們要強調其必要性，另一方面也需針對實驗室的具體條件靈活處理，提出相應的解決方案。大致可以分為以下幾個層次：（1）儘可能使用ISI接近1.0的PT試劑，這種情況下可以使用廠家提供的ISI。或者選擇廠家標註了本實驗室機型相應ISI的試劑，這時也盡量選擇ISI較小的劑型。針對特定的儀器和凝血活酶試劑組合，使用系統特異的ISI，系統特異的ISI與單一ISI相比變異性更低，因此選擇儀器和試劑時應予以考慮。（2）如果ISI接近2.0而且沒有配套凝血儀，又無從獲得口服華法林病人的血漿，應該用商品校準血漿調整本室ISI。用商品化凍乾血漿校準檢測系統，需要注意血漿來源，不同凝血活酶試劑對人為消耗生成的低凝血漿和口服抗凝葯後患者的低凝血漿是有反應差異性的。使用多個獻血員的混合血漿與單一血漿相比可以減少生物變異性，減少線性回歸時數據的離散。(3) 用國際標準品使PT標準化。標本的INR低於4.0時，使用廠家標註的ISI和實驗室重新校準的ISI計算的INR具有良好的相關性，但是高於4.0時則會產生較大的偏差，這種偏差在臨床上會形成足夠的臨床意義干擾正確的治療。國外已經出現了多種標註了INR的商品化質控血漿用於確認檢測程序，假如所有的凝血活酶製劑都根據WHO推薦的方法正確地校準過，那麼用這些凝血活酶測定質控血漿時結果應該是一致的，測得的INR與標註的INR相符，事實上，只有用同一廠家出品的質控血漿和凝血活酶才能得到和標註值吻合的結果。換用其他凝血活酶試劑或者將凝血活酶試劑的ISI重新校準後，INR與標註值相去甚遠。因此質控血漿的使用尚需慎重，避免誤導用戶認為自己的檢測系統不準確。比較好的辦法是使用20個參照IRP用手工法標定PT值的凍乾血漿校準品對實驗室檢測系統進行校正。

綜上所述，可以認為自動化凝血檢測系統具有相互獨立性，儀器之間不存在標準問題。選擇儀器時我們應該考慮那些與手工測定結果接近的和INR變異小的設備。儘管我們一直嘗試著校正自動化凝血儀，但是以何為準呢，這個標準就應該是手工參考方法，通過這種方法獲得標準品的參考值，再對檢測體系加以調整，使儀器測定的INR接近該值。

二、纖維蛋白原的Clauss法與PT衍生法測定差異

纖維蛋白原（Fib）除了診斷低纖維蛋白原血症和溶栓監測等之外，可以作為累及動脈的心血管事件的預測指標，因此用於篩查時就需要足夠標準化和良好的重現性，以便於臨床判斷或解釋。選擇哪種方法用於纖維蛋白原定量測定可以說是老生常談了，除了Fib抗原分析之外，在臨床常規分析中無疑是Clauss方法，但是目前仍有為數不少的臨床實驗室用PT衍生法的計算值報告結果，並由此產生了室間質控甚至臨床報告的顯著偏差，考慮到本刊讀者群體對臨床實際問題的密切關注，我們簡單探討一下PT衍生法Fib（PT-Fib）與Clauss法之間的差異，以及這種差異可能帶來的後果。

從某種意義上說，Clauss法Fib測定是臨床凝血檢驗中唯一能夠實現標準化的指標，即便是使用不同試劑在不同儀器上測定，都應具有良好的一致性。當然，前提是在方法學不受影響的前提下，比如光學法儀器測定乳糜標本時，會因為濁度較大發生結果偏差。用clauss法測定參考品或可溯源的質控品時，不同試劑的結果之間一致性非常好，甚至來自於不同實驗室的結果之間差異都不顯著，從這一點說，參加室間質評時，如果是基於clauss方法，而且在本機上有較好的定標，那麼至少Fib這一項是不該失控的。但是臨床標本不同於參考品，特別是溶栓治療的患者標本，其變異性會略高。

臨床評估發現，測定高值標本時。與clauss法相比，PT-Fib的測定值偏高，而且對校準血漿有依賴效應，它不僅受標本濁度影響，也會因儀器原理或凝血活酶差異產生較大的離散。PT檢測是光散射法還是光密度法，反應終點的判斷方式如何，都是造成PT-fib不具有可比性的原因。一般地說，PT-FIB測定結果略高於Clauss-Fib，兩者之間呈曲線關係，而且隨著FIB濃度的增高，方法之間的差異會有所波動，最大差距甚至可達2g/L。在異常纖維蛋白原血症和溶栓時，Clauss法Fib已經減低時，PT-Fib卻仍然表現為正常。不得不提起注意的是，PT-Fib不僅是儀器之間，在同一系列不同型號的儀器之間也存在差異，比如同樣是光散射法原理定標測定，如果使用了不同系列的反應杯，就會出現散射光與濃度之間的定量關係發生變化，進而出現結果的不一致性。

除了PT-fib的結果略高於Clauss法之外，還有一個特點，即不同試劑測定的結果相關性非常好，但是有可能一種試劑的結果可能明顯高於另一試劑。因此，我們在臨床評估時，單一依靠相關性來說明新試劑是否可靠或有效的做法是欠妥當的，起碼纖維蛋白原這一定量指標應該引入準確度的概念，也就是說不同試劑測定纖維蛋白原時應該使用Clauss直接比較差異性（因為相關性已經成為前提）。

由於纖維蛋白原濃度減低比增高的臨床意義較大也更為常見，因此多數Fib診斷試劑主要針對低水平Fib定量，甚至定標血漿濃度僅略高於4g/L，這就決定了測定高值標本時的靈敏度和特異性是不同的。從這個概念上說，選擇FIB定標血漿顯得尤為重要，作為臨床實驗室來講，不便於獲得國際標準品，多數使用的是廠家提供的定標血漿，由此就帶來了產品差異性。

Clauss法尚且能夠用參比血漿或其衍生定標血漿來保證不同體系測定的準確性，而有些PT-fib是根本不能定標的；甚至個別方法連高值血漿Fib的濃度都不能設定進去，這是因為儀器內部的參數限制，Fib太高用該方法難以得到定標曲線。英國學會在纖維蛋白原測定指南中指出：推薦使用Clauss法纖維蛋白原測定。結合我們的臨床經驗，不推薦用PT-Fib進行試劑或儀器性能比對，特別是在一些重要血栓性疾病時，比如DIC、溶栓、口服抗凝葯或高纖維蛋白原血症時，方法學的差異將表現得非常明顯。

三、關於D-二聚體的認識及其臨床應用

從纖維蛋白原到纖維蛋白形成，在纖溶酶的作用下會降解出一系列的片段，FDP就是評價降解產物多寡的一個常用指標，但是它並不能區別產物是來自纖維蛋白原還是纖維蛋白。在這些降解產物中，由於D-D結構域只能在交聯的纖維蛋白肽鏈的羰基末端之間形成，因此D-二聚體被作為交聯纖維蛋白形成的標誌物，或者說體內有纖維蛋白凝塊形成，D-二聚體與FDP結合分析有助於了解體內纖溶的情況。

（一）為什麼不同D-二聚體試劑的測定結果不可比

由於方法學上的原因，不同試劑測定同一份血漿或全血中的D-二聚體濃度往往不具有可比性。原因包括抗體特異性差異，纖維蛋白降解片段長短不一，針對不同片段製備的單克隆抗體也不一樣，抗體對同一份血漿中不同片段的結合能力也不同；比濁法測定還受到乳膠顆粒特徵的影響，顆粒大小不等在聚集時吸光特性也不一樣，因此不同D-二聚體試劑的差異是不可避免的。

除了方法差異之外，D-二聚體定量的單位也有多種表達，比如ng/ml, ug/ml, mg/ml，還有纖維蛋白原當量單位（FEU），數量級相差很大甚至不可比。更為重要的是，文獻報道的參考值通常受試人群是不同的，種族、生理、性別和年齡的差異都會造成統計結果的不同，即便使用同一種試劑，檢測不同人群時特異性竟然從24%到82%不等。這種方法學上靈敏度和特異性的波動使其應用受到了懷疑，筆者認為，D-二聚體檢測結果的差異性應該在充分理解其生理特點和方法學的基礎上加以分析，比如，抗體對低分子量和高分子量降解產物的檢出能力不同，甚至個別抗體對交聯的纖維蛋白和纖維蛋白原的降解產物之間還存在交叉反應等等。

由於每種試劑所用抗體不同，因此相應的校準物也不同，目前校準物包括交聯纖維蛋白凝塊被消化處理後的血漿，DIC患者的混合血漿，或者高分子量纖維蛋白寡聚體製品等。製造商只選擇適合其產品的校準物，但是一種定值校準物不會適用於另一品牌的試劑，因此，D-二聚體測定沒有參考標準，方法之間校正的可能性也很低。

（二）如何確定D-二聚體的Cutoff值

由於血栓栓塞不單作為一種獨立疾病存在，除了原發性疾病並發血栓之外，外傷和手術等都會造成D-二聚體水平升高，而且年齡和生理病理狀態的影響十分顯著，毫無疑問，靈敏度特異性和預測價值的不一致性也就由此而生。鑒於D-二聚體測定的方法學差異，在應用上很難實現標準化，也不易製備通用型的標準品或校準物，可行的倒是根據每個體系的檢測特性，各自建立具有臨床應用價值的Cutoff值，一方面該值應在大規模臨床試驗的基礎上獲得，另一方面還應根據檢出特徵選擇適當的靈敏度和特異性來確定該值。由於D-二聚體的價值首先體現在過篩上，因此如果Cutoff過低時，靈敏度過高，假陽性過多就失去了檢測的特異性，達不到篩查的效果。而Cutoff過高，假陰性過多，漏診了深靜脈血栓或肺栓塞，後果將不堪設想。Cutoff的選擇不應簡單照搬廠家推薦值，應該參考在權威雜誌發表的有臨床診斷價值的實驗結果，並在使用之初針對本地人群或患者加以驗證。

（三）D-二聚體的量值判斷與臨床決策意義

靜脈血栓包括深靜脈血栓（DVT）和肺栓塞（PE），成年人每年發病率約為0.1%，男性略高於女性，其中大約2/3表現為DVT，另1/3為PE。靜脈血栓的預後不容樂觀，多為死亡、複發、栓後綜合征以及抗凝後的大出血，栓後綜合征的出現使患者的生活質量產生明顯下降，6%的DVT和10%的PE患者出現癥狀後1個月內死亡，PE死亡率高達30%，原發性靜脈血栓病死率較低，而腫瘤並發血栓的死亡率最高。可惜的是，屍檢結果表明許多死亡患者臨床上並未診斷出PE，因此，提高PE的臨床診斷水平對於降低病死率具有重要意義。

血管造影無疑是診斷DVT和PE的「金標準」，但是造影價格相對較高，有侵入性損傷，還受到醫院醫療水平的制約。不造影的話，還可以選擇肺部掃描和超聲，即便不考慮價格因素，這兩種方法也不便作為常規篩查，而且真正有PE的患者用一般肺部掃描也只能發現10-20%。因此，臨床醫生傾向於向實驗室申請D-二聚體檢測，自上世紀80年代以來D-二聚體就用於靜脈血栓診斷的排除診斷，D-二聚體正常或者低於Cutoff值就可以排除DVT或PE的可能了。與血管造影和超聲檢查相比，D-二聚體測定更為簡單便捷，價格低廉。如果臨床認為發病的可能性較低，D-二聚體又是陰性就能夠安全排除靜脈血栓，大大減少進一步的影像學評估。

一種可靠的D-二聚體檢測方法診斷PE的靈敏度可以達到99%以上，特異性為40-60%，陰性預測值（陰性時可以確定不發病的幾率）達到99%，如果將Cutoff水平由500ug/L提高到4000ug/L，那麼D-二聚體的特異性可以達到93%，但是為了避免漏診，不建議盲目提高D-二聚體Cutoff值。

在諸多D-二聚體測定方法中，普通ELISA法對DVT診斷的靈敏度優於定量和半定量的乳膠凝集，定量快速ELISA優於定量和半定量乳膠法，定性快速ELISA優於半定量乳膠凝集。定量和半定量乳膠凝集以及全血凝集法的特異性優於ELISA，定量和半定量以及定性ELISA。其中，ELISA和定量快速ELISA最具陰性診斷價值（似然比分別為0.12和0.09）。對於PE診斷的靈敏度，ELISE、定量快速ELISA（半定量方法稍差）要高於全血聚集法，但是全血法的特異性獨具優勢。進一步細分的話，定性快速ELISA優於ELISA，定量和半定量的快速ELISA，定量和半定量的乳膠凝集法。ELISA、定量或半定量的快速ELISA方法具有較好的陰性診斷價值（陰性似然比分別為0.13, 0.13, 和0.11）。

這些方法的性能評價也不能一概而論，只能說總體上有上述關係，不排除通過抗體改進或引進其他技術升級的新產品具有優良性能。

（四）特殊情況下D-二聚體升高造成的兩難境地

1、術後D-二聚體升高。患者在圍手術期的狀態可以概括為術前缺水，術中低血壓，術後繼續缺水並缺乏必要運動促進血流，加之術前止血和術後抗凝以及手術造成的內皮損傷和組織破壞激活了凝血機制誘發血栓生成。因此，術後D-二聚體升高在所難免，僅憑高於Cutoff值來篩查靜脈血栓顯然是不夠的，積極抗凝結合密切監測有助於預防靜脈血栓的發生，由於篇幅有限，相關問題另文再談。

2、妊娠。妊娠女性發生靜脈血栓的風險比同齡非孕婦高3-4倍，其診斷也更為複雜，比如，非血栓性的小腿腫脹疼痛與靜脈血栓的鑒別。超聲作為診斷非孕期婦女DVT的首選工具，靈敏度和特異性都很高，但是對於孕期常見的髂靜脈血栓或小腿靜脈血栓並不可靠。因此，檢測前的臨床判斷（PTP）和D-二聚體測定被納入了可疑DVT的診斷方案。

由於懷孕期間凝血和纖溶系統的同步活化會出現一系列標誌物的升高，這就給篩查妊娠女性的靜脈血栓帶來的困難。據報道，D-二聚體在一般就診患者中的陽性預測率為18%，但是28孕周以上的婦女檢測的特異性和陽性預測率分別降至49%和9%。即便是沒有任何併發症的孕婦，其血漿D-二聚體水平也會隨著孕齡的增長呈現升高的趨勢。臨床上，總有一些醫生試圖得到一個明確答案：D-二聚體到底超過多少時我們開始抗凝？然而，即便是有學者做過此類調查，我們也不能隨意地推薦，或者簡單地奉行「拿來主義」。何時用何參考值預測孕婦靜脈血栓的發生，應該建立一個真正具有指導價值的時間趨勢曲線來指導排除診斷或者是抗栓治療。

（五）D-二聚體能否用於預後

D-二聚體作為獨立的栓塞風險預測因子，陰性時複發血栓的風險比陽性者低60%。同時D-二聚體升高比低值或陰性的患者血栓標誌物也增高，比如VIII因子，凝血酶原基因突變等，因此可以理解為，D-二聚體水平居高不下一方面是由於纖維蛋白的不斷形成和溶解，另一方面，這些標誌物的升高為複發血栓提供了充分的物質條件。

除了急性冠脈綜合征以外，D-二聚體在如下情況也有潛在的預測價值：急性腸缺血，急性上消化道出血，腦梗塞，動脈纖維化和菌血症等。血漿D-二聚體增高對急性上消化道出血和顱內出血而言預後較差，D-二聚體水平可以作為急性腸缺血時開腹和急性上消化道出血急診內鏡檢查的指標之一；腦梗塞時，D-二聚體可用於病因分析。心源性（來源心臟栓塞而沒有大血管疾病）和動脈粥樣性栓塞（大血管疾病而沒有心源栓塞）時，D-二聚體升高，但是腔隙腦梗塞（皮層下小梗塞）時D-二聚體為陰性。近年來對於D-二聚體預後價值的研究多為回顧性分析，樣本量較小，定量分析少，而且部分研究將診斷DVT的cutoff值用於預後分析，降低了其應用價值。儘管當前國內D-二聚體的檢測呈現迅速增長的勢頭，與方法學和臨床應用相關的問題還很多，還有更多的研究熱點等待我們去挖掘。

作者：解放軍總醫院李健

血栓學檢驗臨床應用中的幾個問題及其理解