楊璐菡團隊Science發文：CRISPR編輯豬，突破異種移植難題！

生物探索

編者按

8月10日，美國eGenesis公司首席科學家楊璐菡、哈佛醫學院的遺傳學教授George Church聯合浙江大學、雲南農業大學、重慶第三軍醫大學及其他科研機構的科學家們共同在《Science》期刊發表最新研究，他們利用CRISPR技術解決了豬器官異種移植的一個關鍵難題，收穫世界首批內源性逆轉錄病毒基因失活的幼豬。

世界上首批內源性逆轉錄病毒基因失活的幼豬（圖片來源：eGenesis）

8月10日，《Science》期刊一篇在線文章再一次將楊璐菡拉入大家的關注視角。這位不久前剛剛榮獲「2017年度全球青年領袖」的中國科學家作為通訊作者，發表了「利用CRISPR技術去除豬細胞內源性逆轉錄病毒基因」的最新成果，解決了豬器官異種移植的一個關鍵難題。

這一研究成果由美國eGenesis公司首席科學家楊璐菡、哈佛醫學院的遺傳學教授George Church聯合浙江大學、雲南農業大學、重慶第三軍醫大學及其他科研機構的科學家們共同完成。它對於移植醫學意義重大，突破異種移植停滯12年之久的困境，為填補人體組織器官移植空缺提供了新的前進希望。

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異種移植的難題：免疫排斥、病毒感染

異種移植是指將一個物種的組織器官移植到另一個物種體內。它是解決器官移植「供不應求」的一大設想。其中，豬成了科學家們最為關注的對象，因為它們的器官大小與人體器官相對接近。而且，豬易於繁殖。但是，這一策略卻面臨兩個重大挑戰——免疫排斥（人與豬的生理差異大）和內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retroviruses，PERVs）。

內源性逆轉錄病毒是殘留在豬基因組中的病毒序列。雖然該病毒對豬本身沒有影響，但是在異種移植過程中，卻存在感染宿主的可能性。

先前，科學家們已經成果將來源於豬胰臟器官內的細胞植入糖尿病患者體內，且並未發現PERV感染的跡象。但是，這一嘗試移植的豬細胞數量很少。對於移植完整的豬器官，不僅僅面臨免疫排斥的難題，還有造成PERV病毒在患者體內傳播、感染的風險。

為了避免風險，科學家們希望能夠利用基因編輯手段將豬基因組中的病毒序列失活。但是，這一策略僅僅只在實驗室培養的細胞繫上驗證過，並沒有在活體動物中實踐。

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藉助CRISPR，精準編輯豬基因組

柏林Robert Koch研究所的病毒學家Joachim Denner曾嘗試利用鋅指核酸酶（ZFN）編輯技術剔除豬細胞內的PERV病毒基因，但是卻因為精準度不高損傷細胞本身而終止。

幸運的是，「魔剪」CRISPR得到了快速的發展和應用。George Church和楊璐菡相信，CRISPR技術在嚮導RNA（gRNA）和Cas酶的「高效搭檔」下能夠精準編輯豬細胞的基因組。

2015年，他們共同創立公司——eGenesis，專註於器官移植領域。楊璐菡出任公司的首席科學家。同一年，他們證實，CRISPR確實能夠在豬基因組的62個位點敲除殘餘的PERV基因。但是，當時研究團隊使用的是一種「不朽」的豬腎臟細胞（可以在培養皿中無限地生存和分化）。為了構建PERV病毒失活的豬，他們需要對提取自活豬體內的細胞進行遺傳改造。

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CRISPR+克隆技術，收穫世界首批無內源性病毒基因的豬仔

在最新的工作中，他們完成了這一突破，在活體豬身上證實了可行性。

研究團隊首次證實，當豬細胞與人類細胞功能培養時，豬細胞內的內源性病毒會感染人類細胞。而且，被該病毒感染的細胞會再次將病毒傳播給其他健康人類細胞。這無疑重申了異種移植病毒基因處理的重要性。

隨後，他們對豬成纖維細胞基因組中的PERVs序列進行了定位和分析，共找到25個拷貝。以尚在子宮內的豬胚胎為研究對象，採集細胞對其進行CRISPR編輯。但是，這些細胞很脆弱：當病毒序列失活效率達到90%以上時，被編輯過的細胞將不能正常發育（這很可能與其DNA受損與關聯）。

為了解決問題，研究團隊配製了包含有DNA修復、促進細胞發育的「化學雞尾酒」。最終，他們在確保細胞正常生長、分化的前提下實現100%的病毒剔除效率，獲得了PERV病毒失活的豬細胞。

為了獲得豬仔，研究人員隨後採用了一種傳統的克隆技術——體細胞核移植，他們將這些經過編輯的細胞核轉移至來源於中國屠宰場豬卵巢中的卵細胞內。最終，他們將培育的胚胎植入代孕母豬的子宮內。

「在我們研究之前，『編輯豬』的思路面臨著很大的不確定性。」楊璐菡表示。現在，他們證實該技術能夠產生活的、健康（至少目前看起來是）的豬，且成功率達到了1%（每100個植入胚胎最終生育出一個豬仔，與克隆技術本身的成功率一致）。

迄今為止，他們共培育出37隻內源性逆轉錄病毒滅活的小豬，目前存活15頭。理論上說，它們的壽命和普通豬的壽命一樣長。

最新研究採取的策略（圖片來源：eGenesis）

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其他學者的聲音：增加異種移植的複雜性？

考慮到PERV病毒的風險並不確切，有科學家擔心，這樣的基因操作會增加複雜性，提高了異種移植的難度。「如果美國FDA批准『PERV-free豬』用於臨床治療，這無疑延長了異種移植的準備時間，對急需器官移植的患者而言並不有利。」 阿拉巴馬大學的移植免疫學家David Cooper認為，「同樣，它還會增加臨床試驗的成本。」

「目前，我並不認為PERV很值得憂慮。」 摩馬里蘭大學醫學院的心臟移植外科醫生Muhammad Mohiuddin解釋道。他的團隊正在與United Therapeutics公司合作進行豬心臟異體移植的研究項目。他計劃將豬的心臟移植入狒狒體內，去年研究團隊發文揭示，這一器官能夠在狒狒體內正常運作超2年。那麼，他會對PERV進行編輯嗎？「如果FDA要求如此，我們肯定是會照做的。」 Mohiuddin回答道。

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下一個目標：解決免疫排斥

很顯然，PERV並不是豬器官異種移植的唯一挑戰。未來，科學家們需要去除引發免疫系統排斥的相關基因，需要插入阻止血液有毒反應的基因。

eGenesis正朝著這些方向努力。「相比於PERV的危險，解決免疫排斥問題的挑戰性更大。」楊璐菡表示，「距離這些經過基因編輯過的豬器官真正投入臨床試驗，還需要幾年時間。」

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參考資料：1）CRISPR Opens Up New Possibilities for Transplants Using Pig Organs

2）Scientists use gene editing to eliminate viruses in live pigs

3）CRISPR slices virus genes out of pigs, but will it make organ transplants to humans safer?

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