醫療器械的生物學評價

知識 08-13

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註明：本文是根據DGSTC醫療器械測試研究總監唐嘯華先生在傘友線下交流活動之《坪山區生命健康產業人才創業系列活動》的發言進行整理而成，本文已獲作者同意發布。

演講者：唐嘯華先生

新的註冊法規在體系和要求上面變得越來越嚴，之前80多家機構可以做審核和註冊，經過上一輪的篩選過後就變成了50幾家，新的法規出台後會進一步篩掉一些公告機構，因此醫療器械的註冊和上市會越來越嚴。

今天圍繞的話題僅僅是圍繞醫療器械的評價與測試這個過程，

首先簡單介紹什麼是生物材料的測試；

第二個要講一下如何進行生物學評價的過程，這裡主要介紹通過測試來進行醫療生物學評價；

第三我講一下ISO10993生物學相容性測試。

醫療器械測試

那麼首先要講的是關於醫療器械測試，這裡簡單的分為兩大類：體外測試及體內測試。首先來看體外測試，舉幾個例子：包括細胞毒性，溶血，遺傳毒性…什麼叫做體外毒性測試呢？就是不需要動物做的測試。像細胞毒性，我們用小鼠型纖維細胞；像血液相容性測試、溶血測試，我們用兔子血或人血；遺傳毒性測試，通常我們用細菌和小鼠淋巴瘤細胞。那麼之所以選擇用細胞或體外測試，主要為了減少動物使用，考慮動物福利的原因。國內也越發注重動物保護動物福利，以後可能會立法。新加坡、法國、歐洲都有比較激進的動物保護者採取了針對實驗動物的保護行動。

因此，現在越來越多研發體外測試或替代測試方法。因後者是比較靈敏的篩選性測試。比如細胞毒性測試大致7天能得到結果，對後續研發或進一步測試很有指向性。但體外測試無法完全代表體內環境的情況。人體內環境有內環境穩態，包括免疫系統，酸鹼平衡，耐受性容錯性更好，因此，不能完全代替體內環境。因此需要做體內測試，選擇動物模型，更接近人體解剖結構和生化條件。研發皮膚類，選擇家兔做模型，因其皮膚更接近人體皮膚。研發心血管類產品，傾向於選擇豬，因其心臟結構最接近人體。因此，當我們希望在更深層次研究和探尋器械功能是否合用的情況下，先做動物測試。當然，要考慮動物福利322原則，盡量減少動物使用，考慮動物的倫理問題，人道和科學地對待動物，不能濫用、虐待動物，對實驗進行詳細計劃，儘可能多地獲取實驗指標。避免重複、無益實驗。

進一步介紹生物材料測試。哪些材料和成分與人體相容性相關，即與人體是否相容。以前更多講的是被動相容性，即對人和動物不產生危害。現在有個新的概念，是主動的生物相容性。即不僅不對人體產生危害，而且還能對人體產生有益作用。因此，目前新的醫療器械的研發對材料提出了新的要求，比如還能促進骨組織癒合，誘導骨組織的生長。

在生物材料的生產過程中，以下因素會影響生物相容性：原材料，直接相關；生產加工工藝過程中的添加劑、污染和殘留物，比如著色劑和染色劑；脫膜、溶解原材料再注塑的過程中引起的污染；殘留物主要指滅菌和消毒過程中的殘留物；濾出物指自然條件下和人體長期接觸過程中產品釋放的物質；降解產物，指人體內的植入物長期接觸中產生的降解產物；以及其他終末產品與包裝材料等接觸帶來的組分。產品設計中的物理和化學特性，都會影響生物相容性問題。

進行材料的生物學評價過程，第一步是做化學表徵測試。比如，醫學級材料是否經過USB classic證書，ISO10993測試等。化學測試僅能測量材料本身是否含有有毒有害物質，還需進一步做動物測試來證實安全性，需按照ISO10993-1部分的附錄來篩選動物測試，考慮材料在人體內接觸的時間和部位，以及臨床應用和已有文獻數據來確定測試方法和計劃。

所有有源醫療器械和無源醫療器械的安全性，都應按照以下流程圖進行測試。

IVD產品因和人體沒有直接接觸，不適用ISO10993原則。首先，先看產品與人體有無直接接觸，比如膏藥，紗布，康復類器械，牙組織體，心血管支架等。間接接觸就包括輸液器，吸氧霧化器導管，通過管路進入人體內部，經由液體和氣體接觸人體。如此，判定是否需要按照此流程來進行測試。首先考慮化學表徵對人體是安全的。有機和無機的化學成分都需要進行測試。通常原材料供應商會提供化學表徵測試報告。當採用原材料供應商提供的材料生產醫療器械，也需要提供化學表徵測試報告。接下來，考慮材料在上市產品中已有使用。另外，器械中組分是否使用了其他材料。生產加工和滅菌過程是否對安全性產生問題。產品與已上市產品相比，與人體接觸和使用過程是一致的。如果所有流程都通過認定。則可進行下一步生物學評價。當其中出現不符合某一流程的情況時，需要用文獻數據，測試數據來支持測試報告。最終，根據測試報告，分析、解釋，對產品的安全性進行闡述，是通過測試還是返回再次研究。

ISO10993中提出了八項原則。圍繞醫療器械的評價流程圖，要求有緊密的計劃，同時強調試驗並非唯一結果，只代表評價醫療器械材料安全性的一部分，需要綜合判定。從實驗設計到發生變化後，這8項原則都需要考慮，一直伴隨研發器械和上市後過程。比如，患者和醫生產生臨床需求後，研發和市場人員考慮是否要研發這一產品，在研發和改進過程中均需考慮生物相容性。當所有研發過程完成後，再考慮是否滿足法律要求。再進一步進行臨床研究，上市後是否有不良事件，競爭對手是否有不良事件等。再對自身產品進行優化和改進。

通過與人體的接觸，醫療器械可分為三類，一類是表面接觸類器械，如紗布等。外部接觸類器械，如內窺鏡，插管，血液透析類設備等，高值耗材類器械，比如支架等植入性器械。按照接觸時間進行分類，包括少於24小時，大於24小時，小於30天；大於30天，風險程度依次提高。隨著時間接觸越長，需要考慮的風險越多，要求的測試標準越高。

生物相容性的評價過程就是考慮化學表徵和測試的過程。材料標準考慮化學測試，是按照ISO10993-18部分，按照與病人接觸的時間和部位進行。同時考慮是否需要進一步的生物學評價。目前國內醫療器械測試和評價，此部分是熱門且重要話題。舉例：心血管支架已出現藥物洗脫支架，可降解支架。是高風險類產品，長期接觸。基本需要做全套的生物相容性測試。國外大致需要100萬人民幣甚至更多，周期很長，需進行植入性實驗等。國內更多接受化學表徵測試和生物學評價。因器械設計已經非常成熟，主要風險來源於材料，考慮安全性便主要考慮其材料的安全性。國外認為，應用化學方法檢測材料的化學特性來判定安全性，精度達到ppM或ppp，百萬級甚至更高級別。靈敏度和精度都很高，以此免除進一步的生物學測試，包括動物學測試等。但國內的標準要求仍比較保守。現階段，對國內企業的要求太高，因為找不到能獨立完成全部化學表徵測試的企業和毒理學評價專家。因此，目前更多的事依靠動物測試來做生物學評價。

關於和人體直接接觸部位的反應，是化學表徵測試無法代替的。植入過後反應需要用植入測試來評價。做生物學評價過程中，並不都需要做動物測試。比如，目前最常見的椎間融合器，選擇的是peak材料，還有骨科的骨釘、骨板等是合金材料，有很長使用歷史，原材料廠家有很全面的實驗數據。生產廠家只是選擇其進行製造，因此不需要進行額外的測試。可以通過尋找測試數據，而不是重新做實驗，來證明其生物安全性。但若用peak材料拿來做關節、牙組織體等新材料。通過機械切割達不到鑄件要求，需要熔融和重塑，對化學有重大改變，則不能使用之前的化學報告，需要做額外的動物實驗。

介紹ISO10993-1及整個標準的重要章節中的生物學測試，體外測試，包括細胞毒性測試，致敏測試（-5章節中）和皮膚刺激性測試（-10章節中）。急性全身毒性測試（-11章節中）。大部分生物學材料都歸於二類中，比較安全。因此主要做此三項測試：細胞毒性，致敏，皮膚刺激性測試。基本所有醫療器械均需做次三項測試。此外，還有急性系統毒性測試，亞急、亞慢性系統毒性測試。還有與人體接觸時間更長者，需做遺傳毒性測試。植入測試，血液相容性測試，包括溶血測試，血栓形成性測試、補體測試、凝血性測試（-4章節中）。以及慢性毒性測試、致癌性測試、生物降解性測試、生殖毒性測試，免疫毒性測試，毒代動力學測試等。研發企業更多不會考慮到材料改變，而是設計上的改變，因此較少涉及材料重新做測試項目的情況。現在較熱的三個測試是毒代動力學測試，免疫毒性測試，生物降解性測試。因更多企業在做新的研發嘗試，使用更多動物源性材料和可降解性材料。

如何進行測試，或與測試機構溝通測試需求。首先，需要製備浸提液。製備浸提溶液，將材料浸泡在其中。分為極性（生理鹽水，細胞毒性測試是特例，用培養基），非極性浸提液（植物油，包括酒精，植物油和菜籽油），額外的浸提液（帶血清的培養基、DMSO、水和酒精的混合物）。如何選擇浸提液，根據相似相溶原理，選擇浸提液就是根據產品所含材料的化學特性選擇。讓企業自行篩選的原因是，產品在某些浸提液中發生溶解，改變了產品特性，不符合測試要求。篩選浸提比例是送檢時非常重要的環節。所有測試方法一致的前提下，浸提比例會影響測試結果。目前針對產品的浸提比例，可選擇厚度小於0.5mm時，選擇6cm2/ml，大多數選擇0.5mm厚度以上，用3cm2/ml。彈性體孔隙結構比較高時，選擇1.25，不規則體選擇0.2g/ml。吸水性物體密度很低，選擇0.1g/ml。還有溫度和時間的選擇，細胞毒性的測試比較特異，應選擇37度，72小時。還有50度，72小時。70度，24小時。121度，1小時。由企業根據產品特性和臨床使用要求自行選擇。選擇適宜溫度和時間進行。較少選擇37度，因為美國FDA不認為37度為嚴苛條件。而動物材料，如含有膠原蛋白者，可以選擇37度。

任何與人體接觸的，均需做測試。可以選擇完整器械或部分器械做測試。舉個實際慘痛案例。一款帶葯支架，準備做CE Mark測試，未選擇完整器械。認為藥物是安全的，有相應說明，只選擇不帶葯器械做測試。通過公告機構的評審，在歐洲註冊成功。2年以後拓展後做美國FDA測試，因未拿完整材料，需重新做測試，花費100萬。建議一定選擇上市的完整樣品送檢。同時考慮市場策略，資金較緊張時，國內檢測所的要求和費用比較低。但產品需要進入國際市場，則一定要選一個嚴格的第三方，做一套完整的測試報告，否則費時費錢。另外，在切片的問題上，也有企業慘痛經驗。因在產品製造過程中，管腔橫切暴露未做塗層的部分，也會影響測試結果。

具體測試有細胞毒性測試，快速篩選性測試，選擇用哺乳動物細胞，最常用的是小鼠神經細胞L929，方法有浸提法，直接接觸法，非直接接觸法（瓊脂擴散法、濾膜擴散法）。評價方法包括在顯微鏡下看生長、形態、代謝情況。材料與人體血液有接觸時，做細胞毒性測試。

如圖，陽性對照，細胞結構破壞嚴重。毒性判定在4級。

另外兩個常見測試，一個皮膚刺激，一個皮膚致敏。這事與人體直接接觸的器械均需做的測試。皮膚致敏測試是免疫原性測試。皮膚刺激是局部化非特異性炎性反應。

如圖，通常用家兔，直接接觸或浸提液與其皮膚接觸，做皮膚測試。觀察紅腫情況打分，計算指數，判斷有/無刺激性。

更深層次，與粘膜接觸或植入的產品，需做皮內刺激反應測試。做成浸提液，打入家兔皮膚真皮層，觀察紅腫情況，判定刺激等級。

皮膚致敏用豚鼠。急性毒性測試也很常規，最早是在美國藥典中測試藥盒的。國內法規是根據測試裝葯容器而開發出來的。主要通過製備浸提液，小鼠腹腔或尾靜脈注入，觀察小鼠臨床癥狀和死亡情況。比如轉圈，體重下降，呼吸不暢等。通常一周得到測試結果。

除了急性，還有亞急、亞慢、慢性測試。是由於與人體接觸時間更長而需要做的測試。具體對動物進行4周，13周，26周的測試。選擇植入，反覆注射的方法進行。觀察體重、血液生化反應、臨床反應、器官重量的變化、病理切片等。這些均是對應高風險類器械的測試。

還有熱源反應，當材料接觸人體後引起發熱，屬於不良反應。可由材料引起或生產工藝引起，由材料引起的用兔子做浸提液注射來做，由生產工藝引起的用細菌做熱源反應測試，看細菌內毒素的凝膠測試情況。

遺傳毒性主要做體外測試，包括細菌回復性測試、小鼠淋巴瘤測試、體外細胞染色體畸變測試。致癌性測試因使用安全材料，涉及較少。生殖毒性測試，觀察是否影響生殖力、致畸性、產前和產後發育。主要針對新型材料，器械涉及較少。植入性測試，通常使用兔子。考慮2-12周的短周期，或大於12周的長周期測試。血液測試如溶血、血栓形成、血液生化分析、血凝、補體等等。

免疫反應測試：新的、動物源性材料可能有免疫學問題，需要考慮。主要包括過敏、免疫抑制、免疫刺激、自身免疫反應等。

如何篩選高質量的測試機構，確保有質量的測試結果。首先，最基本的是，是否具備ISO17025資質。其次，針對醫療器械的臨床前測試，GLP。要求有良好的實驗室規範，測試數據具可靠性、準確性，是可重複、可追溯的。FDA對此有嚴格要求，必須提供GLP測試報告。

最後，研發醫療器械的目的，是治療疾病，幫助患者。而測試的目的，一方面是拿到准證，一方面是客觀評價器械是否已經安全有效。希望企業提交社會的材料和產品是安全的，對病人負責，也是對生產企業自身負責。一旦出現產品問題，處罰力度非常大。國內也會逐漸嚴格監管。

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