CRISPR技術如何將一個性狀定位到單鹼基水平？

來源：百邁客基因

目前將表型和基因型聯繫起來的基本手段是連鎖分析和關聯分析。在這些研究方法中，定位基因的精度受到群體中重組率的限制，通常情況下不能將目標性狀關聯的基因定位到單個基因的水平，只能定位到了一個比較寬的區域。今天介紹的這篇文章利用最近火爆的CRISPR技術將一個性狀定位到了單鹼基的水平。

這項技術是利用了有絲分裂中發生的重組事件進行定位，而不是常規的減數分裂。自然發生的有絲分裂重組事件是在雙鏈斷裂（double strand break）進行修復時產生的。在雜合個體中，細胞分裂會在重組位點處產生完全純合的細胞，而其它非重組位點仍然保持雜合狀態，這種事件被稱為雜合丟失（loss of heterozygosity）已經有人利用這一特性進行遺傳圖譜的構建，原則上來說，這種以及相關的方法都可以用來進行性狀關聯．然而，在自然情況下，重組率的低頻使得這種方法不能很好的實現。

作者已經能夠利用CRISPR-Cas9系統在基因組中任何想要重組的地方進行過高頻的重組，這使得構建LOH-based作圖群體成為了可能。CRISPR系統利用guide-RNA在目標位置切出一個雙鏈斷裂（DSB），在雜合二倍體中，當只剪切其中一條鏈便能產生LOH事件，從而產生同源純合體作為同源重組的模板鏈．這個過程是用雜合多態的PAM位點實現的。

圖一 由Cas9誘導產生的雙鏈斷裂可以導致有絲分裂重組和雜合缺失

為了證明LOH事件可以用CRISPR技術精確的進行靶向，作者設計了95個靶向酵母７號染色體左臂的gRNAs。他們通過將BY和RM兩個菌株雜交產生雜合的酵母菌株，然後再利用他們設計的gRNA在目標雜合位點進行操作。經過剪切、修復和有絲分裂，那些由雙鏈修復產生了LOH事件的細胞用流式細胞儀通過熒光激發被分選出來。一共挑選了384個株系，對這些株系進行全基因組測序表明CRISPR誘導的重組是很有效的，超過95%的株系都發生了LOH事件並且脫靶率很低。75%的LOH重組事件發生在20kb內，與前人評估的LOH基因轉換跡長度相吻合。LOH事件發生在整個目標染色體，表明他們的方法不僅限於特定的基因組上下文。

他們還將通過上述方法構建的LOH群體進行了QTL定位分析，同時與另一個有絲分裂群體進行了比較。他們將384個LOH株系和768個樣品的分離群體在12個不同的條件下進行培養。其中錳離子敏感度性狀在LOH群體中被定位到了2.9kb的區域內。相比於768個樣品的分離群體只定位到了3.9kb的區域中。LOH群體定位的2.9kb中只有兩個基因，12個多態位點。在這兩個群體中也都定位到了8個效應較小的其它性狀。

圖二 LOH事件在定位到錳離子敏感度的染色體上發生

隨後他們又針對對定位到的錳離子敏感度性狀構建了更加精細的LOH群體。他們充分利用LOH基因轉換跡在長度上的可變性。這意味著可以產生很短的重組片段。他們用3個gRNA靶向到2.9kb的區域中，篩選了358個LOH株系，經過測序發現13.1%的株系在2.9kb內發生了重組，並且將這2.9kb內的大多數變異都區分開了。但是在分離群體中只有0.7%的個體在目標區域有重組發生。相比較分離群體中要發生像LOH群體中一樣的重組率群體大小需要達到7500。因此通過CRISPR誘導的可以在任何感興趣的區域產生很強的重組熱點。

圖三 錳離子敏感度基因精細定位

經過更加精細的分析發現在這個區域中有一個Pmr1基因，並且在548位處的SNP可能使得不同的酵母擁有不同的的錳離子敏感度。PMR1是編碼轉移錳離子和鈣離子到高爾基體的離子泵。Pmr1基因是一類P-type ATPase家族中的成員，很多其他的P-type ATPases有一個保守的548位置，編碼亮氨酸或者苯丙氨酸。其它研究表明這一個亮氨酸有直接抓取ATP的能力。在兔子中將亮氨酸突變為苯丙氨酸能影響ATP的結合。因此，F548L多態很可能是影響酵母BY和RM這兩個菌株表現不同錳敏感度的基因。

圖四 直接在BY菌株中引入Pmr-F548L提高了錳離子耐受力

過去幾十年已經有很多性狀通過傳統的圖譜定位方法進行了定位，但是從定位區域中鑒定出潛在的基因仍然有很大的限制。通過CRISPR技術誘導產生LOH群體極大地提高了重組事件發生的密度，同時不需要傳統方法進行遺傳群體的構建，這樣就不需要耗費很長時間。另外，對於數量性狀來說，控制一個性狀的基因中包含很多微效基因，由於在LOH群體中除了目標區域外的基因型其它地方都保持不變，使得可以有效控制目標QTL的遺傳方差。

作者希望基於LOH群體的這種方法能為性狀變異的遺傳給出更多的解釋能力。LOH群體是的我們可以對人類的一些性狀在單細胞生物中可以進行探索。對於多細胞生物來說，如果在生命形成的早期進行CRISPR有到的重組，可以產生一些嵌合體，這些方法已經在蚊子和果蠅中實現了。另外，對於不能進行遠源雜交的物種或者雜交不能產生子代的物種來說，構建LOH群體也有很好的應用潛力。

總結

總的來說，將傳統的基於群體的基因定位方法與新的CRISPR技術進行結合，彌補了傳統方法的一些不足和問題，能夠使得基因定位更加精細，相信隨著CRISPR技術越來越流行，LOH群體的構建也會越來越低成本和容易實現，那麼會有很多的研究者能利用這樣的技術對農作物，水產，果木等物種進行基因定位。

參考文獻：

CRISPR-directed mitotic recombination enables genetic mappingwithout crosses; Meru J. Sadhu, Joshua S. Bloom, Laura Day and Leonid Kruglyak (May5, 2016) published online May 5, 2016

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