靶向肺癌幹細胞的海綿抗腫瘤活性化合物的發現

本研究通過構建肺癌幹細胞模型，對海綿 A aptos aaptos提取物進行活性篩選，並進一步對活性部位進行分離篩選，最終得到1個具有顯著抗肺癌幹細胞活性的aapatmine類生物鹼。

靶向肺癌幹細胞的海綿抗腫瘤活性化合物的發現

劉 曼，劉麗雲，孫 凡，林厚文

（上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院藥學部，上海200127）

【摘要】目的 追蹤並分離海綿 A aptos aaptos中靶向抑制肺癌幹細胞的活性化合物。方法 首先構建肺癌幹細胞A549-Nanog-GFP的藥物篩選模型，用Western blot和免疫熒光驗證構建的肺癌幹細胞模型中乾性基因的表達。利用肺癌幹細胞模型對海綿 A aptos aaptos二氯甲烷萃取物的8個組分進行活性初篩，採用多種色譜分離手段對活性部位進行分離，用CCK8法對分離得到的化合物進行體外抗肺癌幹細胞活性篩選。結果 成功構建了高表達CD44和ALDHIA1蛋白的肺癌幹細胞模型；初篩發現組分D6具有顯著的肺癌幹細胞抑制活性(P<0.01)；從組分D6中分離得到4個aaptamine類生物鹼，化合物AP-l具有顯著的抗肺癌幹細胞活性(P<0.01)，其IC50。值為(3.84±0.12) μmol/L。結論 海綿 A aptos aaptos提取物中分離得到的aap tamine類生物鹼AP-l具有良好的抗肺癌幹細胞活性。

【關鍵詞】aap tamine類生物鹼；肺癌幹細胞；增殖；AP-l

【中圖分類號】R284;R734

【文獻標誌碼】A

【文章編號】1006-0111(2017)04-0304-04

【DOI】 10 .3969/j.issn .1006-0111 .2017 .04 .005

我國肺癌的發病率和病死率位居所有腫瘤前列，且肺癌的治療困難重重。肺癌幹細胞(lungcancer stem cells，LCSCs)是腫瘤耐葯、複發及轉移的重要原因^[1,2]。最早報道的肺癌幹細胞是Kim等^[3]從小鼠支氣管肺泡導管連接處分離出一群Sca⁺CD45^-Pecam^- CD34⁺的細胞，命名為支氣管肺泡幹細胞(ronchioalveolar stem cells，BASCs)。研究者對ALDH1和CD44均高表達(ALDHl⁺CD44⁺)的肺癌細胞進行分析，發現該細胞亞群的幹細胞特性表型均強於ALDHl⁺CD44、ALDH1CD44⁺、ALDHl^-CD44及未分選的細胞群，並且ALDHl⁺CD44⁺細胞具有更強的致瘤性，且對化療抵抗^[4]。將乾性基因SSEA1、Nanog、Oct4等導人腫瘤細胞，獲得幹細胞樣腫瘤細胞作為體外藥物篩選模型技術已日趨成熟^[5]。Chiou等^[6]在體外共表達Nanog和Oct4於肺腺癌細胞，該細胞表現出明顯的幹細胞特性，具有較強的體內成瘤能力及誘導細胞發生上皮細胞間質化改變。因此，利用高表達幹細胞標誌物的肺癌細胞對靶向肺癌幹細胞進行藥物篩選與研究更有意義。

海綿屬於多孔動物門(Porifera)，是最原始的多細胞動物。在其漫長的生存競爭過程中，為了捕食、爭奪領地、驅趕捕食者，形成了複雜而強大的化學防禦體系，體內產生並積累了大量具有特殊化學結構和生理活性的次生代謝產物，已成為海洋抗腫瘤活性先導化合物的首要來源^[7,8]。在國內外已上市的7個海洋藥物分子中，有3種源白海綿：A ra-A、AraC和Halaven^[9]。隨著腫瘤幹細胞篩選模型的日漸成熟，從海綿中發現新型靶向幹細胞的抗腫瘤先導化合物具有重要的臨床價值和良好的應用前景。本研究通過構建肺癌幹細胞模型，對海綿 A aptos aaptos提取物進行活性篩選，並進一步對活性部位進行分離篩選，最終得到1個具有顯著抗肺癌幹細胞活性的aapatmine類生物鹼。

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材料與方法

1.1 材料海綿 A aptos aaptos二氯甲烷層的8個組分及化合物單體由本課題組提供；人肺癌細胞株A549（上海中科院細胞庫）；F12K培養基、胎牛血清、谷氨醯胺、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DM-SO和嘌呤黴素（美國Sigma公司）；CCK8（日本東仁化學公司）；shRNA-Nanog-GFP（上海吉瑪製藥有限公司）；Poly brene助轉劑（美國Snata Cruz公司）；ALD HIA1、CD44、Nanog、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（美國CST公司）。生物安全櫃（美國Thermo Fisher公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；多功能酶標儀SpectraM axM3（美國Molecular Devices公司）；Odyssey雙色紅外成像系統（美國LI-COR公司）。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 肺癌幹細胞培養於含10％胎牛血清和1%谷氨醯胺的F12K培養基(37℃培養箱，5%C0₂)。

1.2.2 慢病毒轉染穩定高表達Nanog-GFP於A549細胞系 將生長穩定的A549細胞以1×10⁴/孔鋪於6孔板中，使細胞在慢病毒轉染時的融合度在50%左右。24 h後，用含6μg /ml poly brene的1 ml新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液，37℃孵育。4h後加入1 ml新鮮培養基以稀釋polybrene。繼續培養24 h，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。一般轉染48 h後可見明顯熒光表達，72 h後更加明顯。如需FACS檢測轉染效率，可在轉染後72～96 h進行。24孔板中，每孔加入嘌呤黴素殺死未轉染細胞。使用無嘌呤黴素培養基，繼續培養，每隔1周需加嘌呤黴素殺死未轉染細胞。

1.2.3免疫熒光染色 將合適濃度的細胞懸液接種於10mm培養皿中，培養過夜後加入預熱的4%多聚甲醛，室溫固定10 min。棄掉固定液，洗滌2次。加入0. 4% Triton-Xl00通透液，室溫孵育15 min。加入1% BSA封閉，濕盒中37℃孵育30min。過夜孵育一抗(Nanog)。洗滌3次，熒光二抗濕盒中避光孵育th。再洗滌3次。加入含DA-PI的封片劑(mounting medium )500μl，靜置10 min左右，4℃避光保存，防止熒光淬滅。於暗處用熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot檢測Nanog、CD44、ALDHIA1的表達水平 提取各組細胞蛋白，通過BCA法進行蛋白定量，蛋白變性後上樣、電泳，待溴酚藍接近膠底部時停止、轉膜，室溫用5%脫脂奶粉封閉2h，PBS洗3次，4℃過夜孵育一抗(Nanog、CD44、ALDHIA1、GAPDH)，洗膜，二抗室溫搖床上孵育th後，經ECL顯色並應用Quantity One軟體進行分析。

1.2.5CCK8法檢測細胞增殖活力 將5×10³個／孔細胞接種於96孔板中，每孔100μl。細胞培養過夜後加入等比稀釋的組分或化合物並設置空白組。每組6個復孔，作用72 h後，棄培養基。每孔加入10μl的CCK8溶液，培養箱內孵育0.5～1 h，用酶標儀測定在450 nm下的吸光度(A)值。細胞存活率(%)一（加藥組A值－空白組A值）／（對照組A值空白組A值）×100%。

1.2.6數據處理 所有數據以表示，使用GraphPad Prism 5.0統計軟體進行統計學分析並製作圖表。多組間比較採用單因素方差分析，組間兩兩比較採用Dunnett"s t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

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結果

2.1 高表達Nanog-GFP的A549細胞中乾性標誌物表達增加通過慢病毒轉染穩定高表達Nanog-GFP於A549細胞系，篩選得到穩定表達Nanog的肺癌幹細胞系。免疫熒光結果顯示，與對照組shRNA相比，shRNA Nanog慢病毒轉染組中95%以上的A549細胞帶綠色熒光，說明Nanog-GFP已成功轉入A549細胞（圖1）。Western blot檢測發現，與對照組shRNA相比，shRNA Nanog慢病毒轉染組中Nanog蛋白水平顯著增加，CD44和ALDHIA1蛋白表達水平也相應提高(P<0.05)，提示該類細胞具有肺癌幹細胞特徵（圖2）。

2.2二氯甲烷萃取物分離得到的8個組分抗肺癌幹細胞的活性課題組前期研究發現4 ap to.s aap tos海綿中活性成分主要集中在低極性的二氯甲烷層，經過減壓柱分離得到8個組分D1～D8，不同濃度的組分(1、10、100mg/L)作用於肺癌幹細胞48 h後，檢測其細胞活力（圖3）。組分Dl~D5對肺癌幹細胞無明顯的抑制作用；組分D6～D8對肺癌幹細胞有抑制作用，組分D6的抑制作用最為顯著。組分D6在濃度1、10和100 mg/L時，對肺癌幹細胞的抑制率分別為(23 .07±1.8)%(P<0.01)、(60 .46±0.9)%(P<0.01和(85 .67±1.2)%(P<0.01)。

2.3 4個aapatmine類生物鹼對肺癌幹細胞的抑制作用使用凝膠柱色譜、正相硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜以及高效液相色譜對組分D6進行分離，得到4個aapatmine類生物鹼AP1～AP4，其結構式見圖4。用不同濃度的AP1、AP2、AP3和AP4（0 .37、1.11、3.33、10. 00 ;μmol/L）作用肺癌幹細胞48 h，檢測其絀胞活力。AP-1、AP-3和AP-4對肺癌幹細胞均有抑制作用，其中AP-1的作用最明顯(圖5)。AP-1在濃度為1.11、3.33和10. 00 ;μmol/L時，對肺癌幹細胞的抑制率分別為(14. 67±0.3)%(P<0.05)、(42. 13±0.8)%(P<0.01)和(91. 57±2.8)%(P<0.01)。經計算，A P-l作用肺癌幹細胞48 h的IC50值是(3.84±0.12)μmol/L（圖6）。

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討論

越來越多的研究證據表明，腫瘤可能是一種幹細胞疾病^[10]。腫瘤細胞在增殖和分化方面與幹細胞具有相似之處。自Lapidot首次基於特異細胞表面標誌物分離出人急性粒細胞白血病幹細胞以來，研究者陸續從膠質瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、結腸癌等臨床腫瘤標本中鑒定出了具有特異表面標誌物的腫瘤幹細胞，為腫瘤幹細胞在實體瘤中的存在提供了有力的證據^[11]。

海綿作為海洋藥物先導分子最豐富的來源之一，研究者從中分離得到了多種抗腫瘤效果顯著的先導分子。但是，目前有關海綿來源具有腫瘤幹細胞抑制活性的分子研究報道很少。2011年，Ottinger首次開展了海綿抗腫瘤幹細胞活性研究。對采自地中海海域的11種海綿提取物進行了抗前列腺癌和胰腺癌腫瘤幹細胞的活性篩選。結果表明，在0.2 mg/ml濃度下，11種海綿提取物均能有效抑制腫瘤幹細胞PaCa2和PC3的生長。其中，海綿Crambe crambe的提取物活性最強，在2.0μg/ml濃度下依然具有顯著的抑制作用，並對正常成纖維細胞和內皮細胞毒性較小。體內成瘤實驗發現，該海綿提取物的抑瘤效果強於吉西他濱，兩者聯用時，體內腫瘤可被完全清除^[10]。由此可見，從海綿中尋找具有靶向抑制腫瘤幹細胞活性的藥物先導分子具有較大的潛力和良好前景。本實驗成功構建了穩定表達Nanog-GFP的肺癌幹細胞A549-Nanog-GFP藥物篩選模型，Western blot結果表明，A549Nanog-GFP高表達ALDHIA1和CD44兩種乾性標記物。利用穩定表達Nanog-GFP的肺癌幹細胞模型，對海綿A aptos aaptos二氯甲烷層的8個餾分進行體外抗肺癌幹細胞活性評價，發現D6對肺癌幹細胞有良好的抑制作用，提示D6中存在抑制肺癌幹細胞的活性成分。使用多種色譜分離技術手段對組分D6進行分離，得到4個aaptamlne類生物鹼AP1～AP4，對其進行體外抗肺癌幹細胞活性評價發現，A P-l對肺癌幹細胞增殖具有顯著的抑制作用，IC₅₀值為(3.84±0.12)μmol/L。課題組初步認為AP-l具有靶向抑制肺癌幹細胞的作用，其具體作用機制還需進一步研究。

綜上所述，海綿 A aptos aaptos中分離篩選得到的aaptamine類生物鹼AP-l具有靶向抑制肺癌幹細胞的活性，這為從海綿中靶向篩選具有特異性抗肺癌幹細胞的活性化合物提供了科研思路，進一步幫助研究人員了解海綿抗腫瘤活性的物質基礎，豐富靶向腫瘤幹細胞的藥物分子來源，同時有望獲得新型抗肺癌幹細胞的先導分子。

【參考文獻】略

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