北大陳興/王初組利用化學蛋白質組學方法定量研究O-GlcNAc糖基化過程

BioArt按：氧連接的β-N-乙醯葡萄糖胺修飾(O-GlcNAc)是哺乳動物細胞中一種廣泛存在於蛋白質絲氨酸和蘇氨酸上的動態、可逆的翻譯後修飾，被其修飾的底物蛋白廣泛地參與到細胞內各種信號傳導通路中。儘管目前已經報道的O-GlcNAc修飾蛋白累積超過1000種，然而該修飾在細胞內的動態屬性卻沒有被深入的分析和探究。7月31日，北京大學化學與分子工程學院、生命科學研究中心陳興課題組與王初課題組合作在PNAS雜誌上以長文形式（PNAS PLus）在線發表題為「Quantitative time-resolved chemoproteomics reveals stable O-GlcNAc regulates box C/D snoRNP biogenesis」的研究論文。該研究通過定量化學蛋白質組學與非天然糖代謝標記技術相結合，系統分析了O-GlcNAc修飾的動態屬性，揭示了其與底物蛋白穩定性的關係，並對O-GlcNAc修飾調控box C/D snoRNP功能的作用機制進行了深入的探究。

論文解讀：

哺乳動物細胞內蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸殘基上存在一種重要的單糖基化修飾--氧連接氮乙醯葡萄糖胺(O-GlcNAc)修飾，其修飾水平由O-GlcNAc轉移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）精密調控，被其修飾的底物蛋白廣泛地參與到細胞內各種信號傳導通路中【1】。在蛋白層面上，O-GlcNAc被報道可以調控蛋白的穩定性【2】和活性【3】。迄今為止，已經報道的O-GlcNAc修飾蛋白累積超過1000種，然而該修飾在細胞內的動態屬性卻沒有被深入的分析和探究【4】。是否所有蛋白上的O-GlcNAc修飾都非常動態？或者不同蛋白上的O-GlcNAc修飾的動態速率是否不一樣？以及O-GlcNAc對不同底物蛋白的穩定性是否有不同的調節？

工作流程示意圖

為了測定O-GlcNAc修飾蛋白的動態變化，陳興和王初課題組基於細胞培養穩定同位素標記法（SILAC）的定量蛋白質組學技術【5】和非天然糖代謝標記技術【6】，合作開發了一種高效的、具有時間分辨力的O-GlcNAc定量化學蛋白質組學分析技術(qTOP)。利用該方法，其研究團隊首先定量鑒定了七百多個高置信度的O-GlcNAc修飾蛋白。在此基礎之上，他們對其中五百多個O-GlcNAc修飾蛋白的動態變化速率進行精準地定量分析，並根據修飾變化速率的快慢對底物蛋白進行了歸類。在此過程中，研究人員發現了數十種O-GlcNAc修飾異常穩定的蛋白，這些蛋白在通過抑制OGT降低O-GlcNAc水平後，其蛋白丰度也發生了明顯的下調，暗示O-GlcNAc修飾與調控底物蛋白穩定性有著密切的關聯。

為了進一步驗證O-GlcNAc修飾對底物蛋白穩定性的影響，作者對其中三個帶有穩定O-GlcNAc修飾的底物蛋白（FBL, NOP58和NOP56）做了詳細的功能驗證。這三個蛋白是box C/D snoRNP複合物的重要組成部分。該複合物負責對核糖體RNA進行2』-O-甲基化修飾，對核糖體生成和翻譯起著非常重要的作用，在很多癌細胞中該複合物都處於高表達狀態並促進腫瘤的生長【7】。通過OGT的小分子抑製劑和siRNA降低細胞內的O-GlcNAc修飾水平，作者發現box C/D snoRNP各個組分的降解速率顯著加快。對於在該複合物中執行甲基轉移酶功能的FBL蛋白，作者成功地鑒定到其142位絲氨酸為O-GlcNAc修飾位點，突變該糖基化位點能夠顯著提高了FBL的降解速率，並且干擾了其在核仁中的定位以及與其它三個組成蛋白的相互作用。而box C/D snoRNP穩定性的下降進一步降低了下游核糖體RNA的2』-O-甲基化修飾水平，並且顯著減緩了腫瘤的生長速率。

綜上所述，該工作通過定量化學蛋白質組學與非天然糖代謝標記技術相結合，系統分析了O-GlcNAc修飾的動態屬性，揭示了其與底物蛋白穩定性的關係，並對O-GlcNAc修飾調控box C/D snoRNP功能的作用機制進行了深入的探究。

據悉，陳興教授與王初特聘研究員為本文共同通訊作者。本文第一作者是他們共同指導的生命科學聯合中心三年級博士研究生秦為。陳興課題組研究生呂品歐、范欣琦、朱蘊韜、覃珂和王初課題組研究生陳影，本科生全柏嶧對本工作做出了貢獻。該研究工作得到了國家自然科學基金委、科技部、和北大-清華生命科學聯合中心的資助。

參考文獻：

1.Hart GW (2014) Minireview Series on the Thirtieth Anniversary of Research on O-GlcNAcylation of Nuclear and Cytoplasmic Proteins: Nutrient Regulation of Cellular Metabolism and Physiology by O-GlcNAcylation.J Biol Chem289(50):34422-34423.

2.Ruan HB, Nie YZ, & Yang XY (2013) Regulation of Protein Degradation by O-GlcNAcylation: Crosstalk with Ubiquitination.Mol Cell Proteomics12(12):3489-3497.

3.Yi W, et al. (2012) Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.Science(New York, N.Y.) 337(6097):975-980.

4.Woo CM, Iavarone AT, Spiciarich DR, Palaniappan KK, & Bertozzi CR (2015) Isotope-targeted glycoproteomics (IsoTaG): a mass-independent platform for intact N- and O-glycopeptide discovery and analysis.Nat Methods12(6):561-+.

5.Ong SE, et al. (2002) Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.Mol Cell Proteomics1(5):376-386.

6.Cecioni S & Vocadlo DJ (2013) Tools for probing and perturbing O-GlcNAc in cells and in vivo.Current opinion in chemical biology17(5):719-728.

7.Marcel V, et al. (2013) p53 acts as a safeguard of translational control by regulating fibrillarin and rRNA methylation in cancer.Cancer cell24(3):318-330.

通訊作者簡介：

陳興教授簡介

陳興，北京大學化學與分子工程學院教授。2002年本科畢業於清華大學化學系，2007年獲加州大學伯克利分校化學博士，隨後在哈佛大學醫學院從事博士後研究。2010年起，任北大化學學院「百人計劃」研究員，合成與功能生物分子中心PI，生命科學聯合中心PI。2016年晉陞為北京大學長聘正教授。2014年獲國家傑出青年科學基金，併入選中組部青年拔尖人才計劃。所獲獎項包括：美國化學會David Gin New Investigator Award (2016), CAPA Biomatik Distinguished Faculty Award（2015）、IGO Young Glycoscientist Award（2015）、葯明康德生命化學獎（2015）、 中國化學會青年化學獎（2013）；美國DuPont Young Professor Award（2013）、SCOPUS青年科學之星金獎（2013）。目前研究興趣主要為化學糖生物學。

陳興教授課題組合影

王初研究員簡介

王初研究員2001年本科畢業於中國科學技術大學生物學系，2007年在美國University of Washington生物化學系獲博士學位，研究方向為計算生物學。2009-2013年在美國The Scripps Research Institute做博士後，研究方向為化學生物學。於2013年12月在北京大學化學與分子工程學院化學生物系開始獨立研究工作，任「青年千人計劃」研究員，併入選北大合成與功能生物分子中心和北大-清華生命聯合中心，任PI。其課題組主要研究方向為（1）運用化學蛋白質組學和化學生物學技術發掘氧化應激條件下，細胞內發生共價修飾的氨基酸功能位點（2）利用組學技術分析和鑒定天然產物生物活性成分在細胞內的分子靶標及作用位點。（3）研發計算生物學方法，對小分子配體對蛋白質共價修飾進行結構模擬預測和分子設計。

王初研究員課題組合影

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