Nature Communication：DNA羥甲基化—基因表達助推器

最新 08-28

導言：古人有云：「牽一髮而動全身」，與此同理，DNA序列上小小的甲基化修飾便會顯著抑制基因表達，從而引發各種各樣的生理疾病。同樣，DNA序列上的羥甲基化修飾也會引起各種疾病的發生。DNA羥甲基化是DNA甲基化(5-methylcytosine, 5mC) 在TET家族酶的作用下氧化產生的，是繼DNA甲基化後新發現的另一種DNA修飾。一直以來，關於5-hmC在心臟疾病中的研究少之甚少，讓我們通過一篇經典的NatureCommunication文章，來看看科學家是怎樣對心肌肥大樣本中5-hmC修飾進行研究的。本文主要是以不同發育時間點和心肌肥大的心肌細胞為實驗載體，剖析了5-hmC在心肌細胞（CMC）基因組中的分布，並揭示了5-hmC在心臟發育和疾病中的作用機制。

技術路線圖

技術路線解析：本文對DNA羥甲基化功能機制展開研究，其研究思路大致可分為以下幾步：1、構建表達譜。通過hMeDIP-seq技術手段，篩選差異表達的DNA羥甲基化位點，構建DNA羥甲基化表達譜。2、探究5-hmC與基因表達的相關性。主要是通過RNA-seq的技術手段來解析不同樣品類型和不同基因位置區域中的5-hmC與基因表達之間的關聯性。3、5-hmC的功能機制的探討。通過生物信息分析探究5-hmC作為增強子的功能，通過Knock down等技術來研究TET羥甲基化調控機制。

1、心肌細胞發育與肥大相關的5-hmC的表達譜

作者先是從小鼠胚胎、1~2天的幼年鼠、2月成年鼠以及心肌肥大鼠中分離了4組不同類型的小鼠心肌細胞（CMC）樣品，然後對其進行了同位素液相色譜和hMeDIP-seq分析，探究4組樣品中的5-hmC的絕對含量和5-hmC在全基因組中的分布。結果顯示，在心臟發育過程中，CMCs中的5-hmC在基因間區域逐漸減少，並向GB上富集。此外，心肌肥大鼠的特徵CMCs中的5-hmC逐漸向小鼠胚胎CMCs的分布模式轉變。

在小鼠CMCs中的5-hmC的基因組分布

2、小鼠CMCs中5-hmC與基因表達相關性分析

為了探究小鼠CMCs在發育和肥大過程中5-hmC與基因表達之間的關係，作者還對4種不同類型的CMCs進行了RNA-seq。共獲得了10302個差異表達基因，根據不同生物學功能可劃分為11個基因簇。通過對差異羥甲基化位點進行表達譜分析，發現5-hmC對基因表達的影響是位置依賴型的，且在不同類型樣品中GB區域和基因間隔區上的羥甲基化位點具有顯著的高表達。

小鼠CMCs中5-hmC與基因表達的相關性

3、5-hmC與特定的基因表達模式相關

為了探究5-hmC在心臟發育和肥大過程中是如何協調基因表達的，作者對4種類型的CMCs中富集到心臟特定表達基因簇進行了表達分析，此外還進行了差異富集分析用以鑒別差異羥甲基化區域（DhMRs）。結果顯示，從胚胎到新生兒和新生兒到成年過渡中，5-hmC的增加與基因表達之間存在顯著的相關性。在胚胎到幼鼠以及到成熟鼠的轉化過程中，其特徵在於GB上的5-hmC顯著性增加，與此相反，心肌肥大的特徵是GB上的5-hmC顯著減少，而基因間隔區的5-hmC有明顯的增加。以上數據說明5-hmC可能是CMCs發育和肥大過程中的重要調控因子。

不同類型CMCs中5-hmC與特定基因表達模式相關性分析

4、5-hmC可強化增強子對基因表達正調控

為了更好的了解5-hmC的功能機制，作者還探究了增強子羥甲基化的作用。實驗發現，5-hmC與基因表達活性區域（H3K27ac+/H3K4me+）具有很強的關聯性。接近5-hmC標記增強子的基因在統計學上比那些僅由H3K27ac標記的增強子具有更強的作用。

增強子羥甲基化的功能

5、TET調控基因的羥甲基化

最後作者探究了TET家族與5-hmC之間的相互作用機制，結果發現在不同類型的CMCs中Tet2表達丰度更高，並且Tet2表達與5-hmC的含量正相關。通過knock down實驗發現，敲除Tet2不影響整體羥甲基化水平，而是在特定的位點上導致了5-hmC的改變，表明TET2介導的羥甲基化特異性調控基因表達。