通過化學誘導的XEN樣細胞實現成纖維細胞的直接重編程

導語：

作為利用化學小分子誘導體細胞向可誘導多能幹細胞重編程領域的著名學者，北京大學鄧宏魁教授及其團隊近期又建立了一套全新的細胞譜系重編程途徑，此研究發表在《Cell》旗下幹細胞領域權威期刊《Cell Stem Cell》雜誌上，論文標題為「Direct Reprogramming of Fibroblasts via a Chemically InducedXEN-like State」。本周由GEMPLE捷易技術部江旭為大家詳細解讀此篇文獻。

文章來源：

背景介紹：

誘導多能幹細胞(inducedpluripotent stem cells, iPS cells)可通過Shinya Yamanaka四因子(Oct4,Sox2, Klf4和c-Myc)或其他因子藉助腺病毒、慢病毒、仙台病毒、質粒等載體轉染體細胞而誘導產生。也可通過小分子化合物的組合對體細胞進行處理,將已高度分化的小鼠成纖維上皮細胞誘導成多潛能幹細胞。

解讀專欄：

01研究思路

本研究中採用「間接譜系轉換」方法，首先將小鼠胚胎成纖維細胞轉換為胚外內胚層樣細胞（Extra-Embryonic Endoderm-like state, XEN-like state）中間狀態，再通過化學小分子誘導，分化為多種功能細胞。

02研究過程

1）化合物的微調以獲得穩定的XEN-likecells

基於團隊之前的研究，研究人員通過一一替換功能類似小分子，微調實驗配方，提高最初克隆形成效率。比較研究發現a GSK3-beta inhibitor：TD114-2比CHIR99021效率高三倍。

A.相差顯微鏡明場圖片形態及誘導克隆效率對比

B.通過qRT-PCR分析TD114-2和CHIR99021兩種組合中XEN標誌主基因(Gata4,Sall4, Sox17, and Gata6)表達情況

C.TD114-2-cocktail的最初克隆的Gata4, Sall4, Sox17, and Gata6免疫熒光

2）探索XEN-like cells分化為Neuronal-likeCells的可行性方案

研究人員採用TauEGFP標記細胞（Tau蛋白：神經細胞含量最高微管相關蛋白）進行XEN-like cells分化研究，優化起始密度改變誘導效率，同時也對TD114-2和CHIR99021兩種組合誘導效率進行了對比。對於培液的化學誘導小分子單獨濃度梯度調整，通過對neural-,fibroblast-, and XEN-specific genes鑒定來實現。

D.Neuronal-like Cells誘導流程示意簡圖

E.不同起始密度對於TauEGFP-positivecells效率的比較

F.TD114-2-cocktail誘導的TauEGFP-positive克隆前後期比較的一個代表性圖像

3）對於誘導出的TauEGFP-positive神經元表達情況進行鑒定

研究人員為進一步了解整個重編程進程，對誘導出的神經元進行了基因表達分析，發現神經元相關方面基因表達上調（突觸傳導、離子通道、神經元分化發育），成纖維細胞相關基因表達下調（細胞黏附、細胞遷移及生長）。研究結果表明化學小分子誘導的神經元與原代神經元轉錄表達類似，顯著區別於成纖維細胞表達情況。

A-E.共表達神經元標誌TUJ1, NF-H,MAP2和SYN的免疫熒光

F-H.功能亞型及成熟神經元表達標誌基因免疫熒光

H.膠質細胞共培養長期培養後成熟神經元比例

G-H.通過RNA-seq聚類分析，同時比較基因的上調與下調

4）對於誘導的神經元進行功能性研究

通過移植到成年小鼠大腦紋狀體內來驗證誘導誘導神經元體內功能表達情況（遷移、成活、成熟發育），判斷是否嫁接成功，通過胞內核計數排除細胞融合情況，最後檢驗新鮮腦切片的電生理特性。實驗結果表明XENlike-state-誘導的神經元細胞具有體內功能表達能力。

I.誘導細胞與膠質細胞共培養後的膜片鉗記錄

J.TauEGFPpositive induced cells動作電位痕迹

K.TauEGFPpositive induced cells全細胞電壓鉗記錄和內向電流記錄；鈉電流被tetrodotoxin (TTX)堵塞後記錄

L. 20 uM CNQX plus 50 uM AP5阻斷，與原代星形膠質細胞共培養後的自發興奮突觸後電流記錄

M.100 uM glutamate焦點應用誘導內向膜電流

N．將Tau-EGFP陽性神經元向小鼠腦內移植的示意圖；

O-Q.移植後的Tau-EGFP陽性神經元能夠存活並逐漸成熟，均為單核細胞，且能檢測到動作電位的發放.

5）驗證出生後的成纖維細胞對本方案的可行性

為了驗證出生後的成纖維細胞產生XEN-like樣細胞來源的神經元對於本實驗方案的可行性，研究人員對新生和成年的成纖維細胞進行編程實驗，實驗結果表明胚胎來源的XEN Cells也可以用該方法誘導為神經元，只是效率不同（加Vitamin C減少衰亡與CH55提高效率）。證實了該方案對於成纖維細胞不同起始狀態的普適性。

6）動態轉錄變化研究

a.通過研究發現，整個誘導轉化過程中無多能性標誌基因表達，即越過了多能性獲得這一過程。

b.整個實驗過程中間伴隨stage1：XEN克隆形成神經及XEN標誌基因上調，stage2：神經元誘導XEN標誌基因下調。

c.進一步研究神經及XEN標誌基因（Sox2和Gata6）在誘導重編程中的作用，用smallhairpin RNA (shRNA)敲低神經主導基因(Sox2)或XEN主導基因(Gata6)。表明：Sox2和Gata6在整個編程過程中是必不可少的標誌表達基因。

7）針對於XEN-like cell自身進行深入的研究

a.細胞增殖、形態、基因表達、基因組、染色體數目、核型是否正常穩定，具備可持續穩定傳代擴增條件。

A．成纖維細胞、胚胎幹細胞及胚外內胚層樣細胞的細胞數量翻倍所用時間；

B．2代及20代的胚外內胚層樣細胞的相襯圖像；

C．20代的胚外內胚層樣細胞共表達胚外內胚層樣細胞主導基因（Sox17，Gata4，Gata6，Sall4）；

D．胚外內胚層樣細胞的核型分析；

E．不同代次的胚外內胚層樣細胞的染色體數目的分布，n代表供檢測的細胞數；

F．胚外內胚層樣細胞的基因組雜交分析；

b.長期維持傳代都是否具備分化能力。中間維持XEN-likestate或擴增後分化功能表達研究。

G．成纖維細胞與胚外內胚層樣細胞的全基因組表達熱圖；

H-I．由高代次胚外內胚層樣細胞誘導產生的Tau-EGFP陽性神經元表達了典型的神經元標誌物，且具有電生理活性；

J．不同代次的胚外內胚層樣細胞誘導產生的Tau-EGFP陽性神經元的分化效率；

K．不同代次的胚外內胚層樣細胞、初級神經元、腦細胞、成纖維細胞的聚類分析；

L．規模化擴增胚外內胚層樣細胞的示意圖.

8）探討XEN-like state能否分化為其他細胞的能力

研究人員設計了XEN樣細胞分化為肝細胞（內胚層）的實驗，並驗證了其可行性。結果表明XEN樣細胞具有分化為各胚層其他功能細胞的可塑性。

03研究總結

本研究證明化學小分子誘導的XEN-like state cells能誘導為多種功能型細胞，例如神經元及肝細胞等，並且XEN-like cells能長期擴增，基因組維持穩定。本研究的主要意義在於：通過XEN-like State化學小分子直接編程誘導分化其他功能型細胞的可塑性路徑研究，揭示了一種新的細胞間接譜系轉換的新方法，建立一種新的中間轉換細胞體系，為以後研究提供了一個新思路。

以上就是文章《Direct Reprogramming of Fibroblasts via a

Chemically Induced XEN-like State》的全部內容啦，若有疑問歡迎隨時諮詢！我們下期文獻詳解再見！

稿件來源：技術部江旭

稿件編輯：GEMPLE捷易市場部

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