CRISPR最新重大進展：基因編輯技術終於出現「停止鍵」！

隨著 CRSIPR 的大熱，基因編輯技術已經離我們越來越近。但事實上，這項技術依舊存在著不小的隱患，其中最大的一個問題就是基因編輯的脫靶效應。

這是因為，基因編輯一旦開始就無法中斷，只能等待整個過程自然結束，就好像一輛汽車只有油門但是沒有剎車。在修復了錯誤基因後，細胞里的基因編輯工具很可能會繼續修改本來正常的基因。因此，科學家一直想在基因編輯的工具箱里加上一套「剎車裝置」。

2017 年 8 月 24 日，著名的基因編輯專家，CRSIPR-Cas9 系統的共同發現者Jennifer Doudna 和她的同事在《細胞》雜誌上發表了一篇論文（A Broad-Spectrum Inhibitorof CRISPR-Cas9），他們發現了兩個可以終止基因編輯過程的蛋白質。不僅如此，他們還發現這兩個蛋白質屬於一個很大的蛋白質家族，這個蛋白質家族對不同的基因編輯系統有廣譜抑制性，意味著在未來的終止基因編輯過程中可能得到廣泛應用。

圖丨CRSIPR-Cas9 系統的發現者之一Jennifer Doudna

這項研究不僅能讓研究人員更加深入地理解基因編輯系統，而且還可以給他們提供一套操作工具，能更好地控制基因編輯系統，讓它變得更精確，副作用也更少。

CRISPR-Cas9 系統本來是細菌用來抵禦病毒的免疫工具。不過在過去幾年，研究人員發現這套系統也可以相對精確地定向修改哺乳動物和植物等生物的基因。因此已經有大量的研究開始關注 CRISPR-Cas9 在遺傳疾病治療和轉基因物種培育等領域的潛在應用。

在健康領域，中國和美國都已經開始了相關的臨床試驗，這標誌著CRISPR-Cas9 已經逐漸走出實驗室，進入市場應用前的最後階段。很多人相信，基因編輯很快就能被用於臨床治療。

然而 CRISPR-Cas9 系統也有問題。作為潛在的醫療手段，它的精確度仍然不夠。例如，有時候基因編輯會出現在我們不想要的地方，產生脫靶效應。另外，因為基因編輯非常強大，生物倫理學領域的學者也擔心在實驗室外使用基因編輯是否會產生可怕的後果。因此，科研人員面臨的一個重要問題是找到更多可以精確控制基因編輯的工具，讓這種技術變得更加安全可靠。

就像發現 CRISPR 系統那樣，研究人員再次把目光轉向了自然界。CRISPR 系統是細菌用了數億年時間，進化出來的抵禦病毒攻擊的防禦性武器。當病毒入侵後，細菌可以捕捉到病毒的 DNA 片段。如果病毒再次入侵，細菌就能根據之前的記錄找到入侵者的 DNA，然後再利用 Cas9 的蛋白質把病毒 DNA 摧毀。

不過，細菌和病毒之間的鬥爭已經持續了很久。病毒也同樣進化出一套機制來抵禦細菌的免疫系統。它們的基因組可以合成一些蛋白質，這些蛋白質能抵抗細菌的防禦性武器 Cas9。

此前，已經有多項研究發現了至少 7 種蛋白質，可以抑制 Cas9，讓細胞無法切割編輯 DNA。研究人員將這些對抗 CRISPR 的蛋白質統稱為 ACR抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR protein，簡稱ACR）。不過，他們基本不清楚這些 ACR 蛋白是如何工作的。

所以，Doudna 和她的同事決定弄清楚 ACR 蛋白的機理和作用範圍。他們選了兩個 ACR 蛋白：ACRIIC1 和 ACRIIC3。選擇這兩個蛋白的原因是它們都可以在人體細胞里，非常有效地抑制一個很常用的 Cas9 蛋白。

有趣的是，研究人員發現，這兩種蛋白質抑制基因編輯的方式截然不同。ACRIIC1 可以抑制很多不同的 Cas9 蛋白，有廣譜抑製劑的效果。當它在細胞中遇到 Cas9 以後，可以緊緊地結合在 Cas9 用來抓住 DNA 的位置上，讓它無法再與 DNA 結合，並進一步切割破壞 DNA。這就好像在插線板上插入一個塑料保護套，就無法連上插頭一樣。

圖丨左上：紫色的「DNA剪刀」Cas9蛋白可以切割基因，完成基因編輯的過程。右上：當紅色的 ACR 和紫色的Cas9結合以後，Cas9無法再和DNA結合，基因編輯終止。

研究人員通過 X 射線結晶法，獲得了清晰的 ACRIIC1 和 Cas9 結合在一起的結構。具體地說，ACRIIC1 上的兩個氨基酸（S78和C79）和 Cas9 上的兩個重要的氨基酸（H588和D587）之間形成了緊密聯繫，而 H588 和 D587 本來是 Cas9 用來抓住目標 DNA 的。（如下圖）

圖丨Doudna團隊獲得了 ACR 蛋白（橘黃色）和Cas9蛋白（紫色）結合的清晰結構。ACR 蛋白的兩個氨基酸（C79和S78）分別與Cas9的兩個氨基酸（D587和H588）形成了化學鍵。

另一個 ACR 蛋白 ACRIIC3 的作用機理則完全不同。首先，它更加專一，只能抑制一種 Cas9 蛋白。其次，ACRllC3 並沒有直接結合到 Cas9 的反應位點上，而是把兩個 Cas9 拉到一起，大幅度改變了 Cas9 的結構，讓它失去了與 DNA 結合的能力。

圖丨在電子顯微鏡下，可以清楚地看到，在加入ACRIIC3前（左圖），Cas9單個存在。加入ACRII3後（右圖），兩個Cas9結合到了一起。

和之前的研究相比，Doudna 和她的同事在《細胞》上發表的最新論文更透徹地研究了抑制基因編輯的機理。他們不僅通過生物化學的方法確認了抑制活性，還通過結構生物學的方法掌握了 ACR 蛋白質克制 Cas9 的原因。

而到現在為止，我們還沒有方法可以終止基因編輯的過程。一旦基因編輯的流程啟動，就只能等待整個過程自然結束，就好像一輛只有油門，沒有剎車的汽車。之前有研究表明，CRISPR-Cas9 可以擊中準確目標的基因編輯中，有大約一半發生在編輯過程開始的 6 小時內。而在 6 小時後，脫靶的編輯開始變多。

布羅德研究所的生物科學家 Dane Hazelbaker 曾表示，利用 Cas9 進行基因片段切割非常容易，但重要的是要能控制它。如果把 Cas9 比作一位外科醫生，他擅長的是闌尾炎切除術。但如果你想只是切除闌尾，而不損傷旁邊的膽囊，你就需要 ACR 這樣的 Cas9 酶活抑製劑。它就像「能在手術剪刀剪向重要器官之前，狠狠拽開拿著剪刀的雙手。」

現在，科研人員認為他們已經發現了這雙可以「拽開剪刀的雙手」。之前有研究表明，即使在 6 個小時後添加 Cas9 抑製劑，也能把脫靶效應降低一半。當時參與這項研究的加州大學舊金山分校的 Joseph Bondy-Denomy 就表示，Cas9 抑製劑可以在基因編輯完成之後，準確地定時關閉 Cas9 產生，而不會讓 Cas9 在細胞中停留而冒險產生脫靶效應。

除了讓時間窗口變得更精確，Cas9 抑製劑還可以讓 CRISPR-Cas9 系統的針對性更強。研究人員有可能在未來將 Cas9 的抑制蛋白加入基因編輯系統里，讓我們能針對某個特定的器官、組織、發育階段的的細胞進行基因編輯。

值得注意的是，Doudna 等人還發現，整個 ACR 家族的抑制範圍，比之前想的可能要廣泛得多。這些蛋白不僅有可能抑制可以切割雙鏈 DNA 的 Cas9，甚至還有可能針對切割單鏈 DNA 的限制性內切酶。

作者在論文的討論部分也表示，隨著基因編輯工具的增加，像 Arc 這樣廣譜的控制工具也變得越來越重要。持續研究不同的 ACR 蛋白的機理，將提供一個獨一無二的機會，讓我們更好地對基因編輯進行控制。

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