湖泊水庫中藍藻及藍藻毒素的監測技術和管理策略

小編導讀

水源型湖泊與水庫的管理對於全面保障城市水資源的安全具有戰略性意義，其中尤以湖泊水庫中藻毒素及其他新型有機污染物質的控制最為關鍵。本期欄目以藍藻毒素的實時監控和管理為切入，以「第四屆國際水協湖泊與水庫管理研討會」的相關最新研究成果為基礎，匯總提煉相關信息，供讀者參考。

在湖泊和水庫的管理和維護工作中，藍藻爆發問題一直都是不可迴避的世界性困擾。原水中以微囊藻毒素（microcystin）、節球藻毒素（nodularin）、擬柱孢藻毒素（cylindrospermopsin）、蛤蚌毒素（saxitoxin）等為代表的多類藻毒素物質，以及土臭素（geosmin）和2-MIB等嗅味物質，都是藍藻細胞的代謝產物，它們對人體的腸胃、肝臟等器官均會造成損傷，甚至具有一定的致癌性。近年來藍藻水華出現的頻率和強度呈現增長的趨勢，由此帶來的水生生物和人類中毒問題、飲用水處理中的毒素積累問題、飲用水的異嗅異味問題、暴露於藍藻水環境的娛樂活動對人體健康的影響，以及使用存在藻毒素污染的地表水或再生水灌溉植被所造成的食物安全問題，都是關乎人類生存發展的嚴峻課題，亟待學術界和政府部門的共同攻關。因此各地水司必須採取一定的管理策略，建立和完善藍藻爆發預測機制，確定藍藻的預警濃度值，及時採取干預措施，有效地控制和避免藻類爆發事件的發生。其中快速準確地監測原水中藍藻細胞的濃度，以及相應藻毒素和嗅味物質的濃度，迅速判斷其是否超過預警值，是這些管理措施得以順利落實的先決和關鍵所在。基於此，「第四屆國際水協湖泊與水庫管理研討會」開設了「藍藻毒素監測和管理」專題，來自全球各地的專家學者就藍藻監測和管理領域的科研成果、管理經驗、政策導向以及技術瓶頸等展開了廣泛的探討和交流。本期情報彙編對此進行了提煉和梳理，望能給相關從業人員以新的啟發和思考。

1

藍藻在線監測技術

1.1

qPCR技術和ELISA技術

近年來，實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術（qPCR，real-time quantitative PCR）和酶聯免疫吸附測定技術（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）在藍藻及其相關代謝產物在線檢測中的應用逐步廣泛。ELISA技術是把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機結合起來的一種檢測技術，既保持了酶催化反應的敏感性，又具有抗原抗體反應的特異性，可簡單有效地檢測水樣中微囊藻毒素、擬柱孢藻毒素等毒素的存在情況。qPCR技術是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化[8]，可快速地檢測水庫原水中與毒素、嗅味物質等藍藻代謝產物的產生相關的基因。

Lin團隊利用qPCR、ELISA、顯微鏡觀察以及GC/MS等檢測手段（如圖1所示），考察了微囊藻毒素、擬柱孢藻毒素、蛤蚌毒素等藍藻毒素和2-MIB等藍藻代謝產物，與相關基因之間的相互關係。結果表明，對於微囊藻毒素、擬柱孢藻毒素和蛤蚌藻毒素來說，其母體藍藻數量、毒素濃度以及和毒素表達相關的基因複本數量之間的線性關係顯著。利用此方法調查台灣和菲律賓水庫中藍藻和藍藻代謝污染物的存在情況，發現微囊藻、擬柱孢藻及其各類代謝產物的存在情況較為顯著，而部分地區微囊藻毒素、擬柱孢藻毒素的濃度超過了世界衛生組織（WHO）建議的飲用水指導濃度（1.0 μg/L）。

圖1 藍藻、藻毒素和嗅味物質的檢測方法

此外，由於藻類代謝產物的濃度和相應基因的丰度之間存在良好的線性關係，加之基因方法更加省時，且對代謝產物具有高度的專一性，因此Lin等提出了可設置三個級別的微囊藻和擬柱孢藻的基因丰度警戒水平（如表1所示），作為WHO和澳大利亞水質中心原先建議的微囊藻毒素和擬柱孢藻毒素的三個級別警戒濃度（0.3、1和10 μg/L）的補充，以更好地建立針對水庫藍藻爆發和藍藻毒素超標的預警系統。

表1 根據藻類代謝物質產生基因建立的預警水平

1.2

熒光探針技術及環境因素的影響

常規的藍藻濃度測量方法有無需化學提取的顯微鏡計數法，以及需要提取藻類特徵物質（如色素等）的定量聚合酶鏈反應法（qPCR），然而它們都依賴於技術人員的熟練操作，且分析結果存在滯後性，無法在短時間內得到準確穩定的分析結果。與此同時，近年來逐漸發展的熒光探針技術（fluorometric probes）可實現原位在線估測藻類細胞的濃度，為快速及時地預測藍藻爆發，提供了理論依據和技術途徑。

然而在實際的複雜水環境中，熒光探針的檢測往往存在各種干擾，干擾來源主要有：1）藍藻細胞自身的特性。藻青蛋白在不同藍藻細胞內的含量和聚集形態不同；光曝前後的藍藻細胞可能存在差異；其他物種所含的葉綠素a以及藻膽色素（藻青蛋白和藻紅蛋白）會影響熒光的檢測；在自然環境中，胞內和胞外色素之間存在色差。2）水質狀況，如濁度、水溫以及水中顆粒物造成的光散射等。3）熒光探針設備本身在測量熒光的同時，也需要估測細胞數、生物量等參數對原始數據進行校正，此處也會存在一定偏差。

針對此，Zamyadi等基於顯微鏡計數法、生物量估算、藻青蛋白提取以及嗅味物質分析等手段，考察了諸如濁度、生物量、其他藻產生的熒光以及設備自身的校正等因素對目前市售的6種熒光探針設備的影響。

研究表明，當懸液中只存在單一藍藻時，顯微鏡計數與6種熒光探針的試驗結果相關性均較好，表明熒光探針技術的穩定性較佳；同時，當藍藻濃度較低時，探針檢測結果的重現性良好。然而在實際應用中，水體中往往含有多種藻類，且水質情況更為複雜，在這種條件下，熒光探針檢測藍藻的試驗結果存在一定偏差。當水體中的綠藻濃度和濁度增大時，熒光探針測得結果的偏差也變大；與此同時，通過平行測定水體中葉綠素a的含量，在一定程度上可以有效地修正熒光探針所測得的藻青蛋白剩餘信號，使檢測結果更加準確。對比各熒光探針設備的試驗結果，選擇綜合效果最佳的一款設備應用於實際的藍藻實時檢測中，結果顯示該熒光探針設備能夠很好地檢出澳大利亞某水廠的進廠水中較高含量的藍藻。圖2為實際水廠中的實時熒光探針檢測設備。在此基礎上在水源地或水廠內施以適當的前處理工藝（如投加高錳酸鉀等）進行調整，就能有效去除水中的藍藻。

圖2 澳大利亞某水廠中的熒光探針檢測設備

未來在該領域的研究熱點包括通過基因組學（genomics）手段得到水中生物的更多信息，以及結合高密度的原位熒光檢測和詳盡的基因組學信息建立藍藻的預測模型等。

1.3

激發-發射光譜法

Lee等介紹了一種熒光技術——激發-發射光譜法（EES，Excitation-Emission Spectroscopy）在藍藻實時監測中的原理和應用，並對EES法和qPCR技術各自的優勢進行了總結和比較。

藻類的色素分子（葉綠素a等）吸收光線後，所吸收的一部分能量會重新以熒光的形式激發出來。由於同一綱目的藻類所含的色素性質和數量相似，其發射的熒光具有相似的能量，因此在特定的發射波長（680 nm）下產生的熒光光譜是獨一無二的；與此同時，同一綱目藻類受到不同波長的光照射時，發出的熒光強度也不同。因此可根據不同波長的激發光來區別不同綱目的藻類（綠藻、藍藻、褐藻、紅藻等）。葉綠素a作為一種光合色素廣泛存在於所有的藻類細胞中，因此通常可通過葉綠色a的熒光信號來檢測藻類的存在水平；但藍藻細胞產生的葉綠素a熒光信號相對較弱，因其熒光發生系統主要位於光合系統II，故藻膽素（藻青蛋白）產生的熒光強度更高，所含的光譜信息更加豐富，更適合用來估測藍藻細胞的丰度。

基於EES，Lee等介紹了某公司研發的在線藻類監測感測器，可通過7種不同波長（365、450、525、570、590、615和710 nm）的激發光來監測水中不同藻類的存在情況。如圖3所示，儀器在工作時，7種不同波長的激發光以很高的頻率逐次對水樣進行照射，通過測算不同波長的激發光對不同藻的「激發值」，即可得到不同藻類的濃度。同時，儀器會檢測水樣的溶解性有機物（DOM）和濁度值，對得到的藻類濃度進行修正，以提高結果的準確性。

圖3 基於EES技術的在線藻類監測感測器的工作原理圖

EES技術和qPCR技術的比較如表2所示。

表2 EES技術和qPCR技術的比較

EES技術的優勢有：1）穩定高效，可在目標水域環境中快速安置實時監測系統；2）可連續提供與藍藻爆發相關的關鍵數據；3）可根據實際場景選擇攜帶型或固定式設備；4）可依託該技術建立水華預警系統。EES技術未來的發展趨勢有：1）採用在線流式細胞儀（online flow cytometry）來計量藍藻細胞的數量；2）在系統平台上將EES技術和水體凈化技術相結合（如投加H2O2或採用超聲處理技術）。

qPCR技術的優勢有：1）可用於分析毒性藍藻的丰度在時間和空間上的分布情況，建立其在水體環境中的種群動力學模型；2）可同時分析多個藍藻基因，適用於複雜水華的評估；3）靈敏度高（

將兩者相結合以實現對毒性藍藻的實時監測，也是今後重要的研究方向之一。

1.4

平面波導陣列生物感測檢測器

鑒於傳統的HPLC、GC/MS等方法檢測微囊藻毒素比較費時費力，且需要消耗大量化學試劑，Zhou等介紹了一種基於倏逝波場（evanescent wave field）、能快速和同時定量多個樣品中的微囊藻毒素的平面波導陣列生物感測檢測器（planar waveguide array biosensor）。

該裝置的示意圖如圖4所示。儀器的主要構成元件包括：一端面為一定角度斜切面的平面波導基片（planar waveguide chip），用來向波導基片斜切端面邊緣發射激光的線發生器（line generator），用來引入樣品至波導基片表面的可拆卸的聚二甲基硅氧烷流動室（PDMS flow cell），由16根塑料光導纖維組成的信號收集系統，以及數據處理系統。

圖4 平面波導陣列生物感測檢測器的工作原理圖

樣品採用間接競爭免疫法（indirect competitive immunoassay）進行分析測定。先將做過標記的抗體以一定的濃度和待測樣品充分混合一定時間，使待測物完全佔據抗體的結合位點，這一過程稱為「預孵化」（pre-incubation）。隨後樣品被送入流動室的獨立線性通道，樣品內未同待測物結合、還存在自由結合位點的抗體，與基片上的半抗原共軛物（hapten conjugate）結合，形成生物感測面，這一過程稱為「孵化」（incubation）。「孵化」反應後，固定下來的抗體量，與樣品中待測物質的濃度呈反比，且與被倏逝波場（由全反射光線產生）激發所形成的熒光信號的強度之間，存在對應關係，可被量化。產生的熒光信號被基片下方的平行多模式纖維收集，由數據處理系統進行處理，對背景信號雜訊進行分析和修正，得到最終定量結果。

在最優試驗條件下，該檢測方法的檢出限可達到0.67 μg/L，達到了飲用水國家標準（GB 5749-2005）中微囊藻毒素的檢測水平。該方法檢測靈敏度高，且可以同時定量多個樣品中的微囊藻毒素，具有很好的應用前景。

2

藍藻監測管理策略

2.1

新加坡水庫藻毒素監測和管理的策略和方法

作為一個陸地面積只有719km2而人口密度高達7 600人/km2的島國，水資源緊缺問題一直都是新加坡國家發展和民眾生存必須面對的挑戰。為此，新加坡的國家水務機構PUB一直都致力於通過先進高效的管理和技術手段來提供可持續的供水服務。目前新加坡境內共有17座飲用水水庫，確保水源地的水質安全，是確保生活、生產、娛樂活動等用水安全的重要前提，也是PUB水質管理一體化方案中的關鍵環節。作為一個熱帶國家，新加坡水庫擁有種群數量較多的藍藻，必須時刻警惕藍藻爆發的潛在風險，為此PUB很早便將相關的防護舉措納入了其水安全計劃框架。來自PUB的專家Mong Hoo Lim在會上介紹了新加坡在藍藻和其代謝產物的監測、風險評估以及控制管理方面所擁有的成熟技術和經驗。

2.1.1

源頭控制

對N、P等營養物質的源頭控制，是全球各地公認的控制藻類生長的關鍵策略。在這方面，PUB將重心放在使潛在污染源的營養物負荷最小化上，事無巨細，例如，及時對下水管道進行修復以減少污水滲漏，防止餐飲業密集區域的污水和垃圾進入城市水道，防止施工地區的土壤因暴露而流失，提升車間的清潔技術以及使用環境友好的水路交通工具來減少油類污染物的排放等等。與此同時，藉助曝氣，以及通過各水庫之間的水力調度使水流循環強化（如濱海水庫循環計劃，Marina Reservoir Recirculation Scheme）等手段，達到控制藻類生長的目的。此外，公眾參與也是PUB管理計劃中的重點和亮點，根據一項名為「Active, Beautiful, Clean Water」的計劃，經污染防治措施整改過的河道和水庫，會通過適當的娛樂活動形式吸引市民前來參觀遊玩，既引導公眾參與監管，同時也教育公眾時刻珍惜新加坡寶貴的水資源。

2.1.2

水質監測

從飲用水源頭到居民自來水龍頭，PUB有一套綜合的水質監測方案。在湖庫藍藻管理方面，除採用在線垂直水質分析和實驗室分析對營養物質等在內的常規水質參數進行監測外，葉綠素a濃度、藻細胞計數、藻毒素濃度等也是PUB密切關注的參數。新加坡水庫共設有22套在線水質分析設備，並配備「絞車系統」（winching system），每隔15分鐘就會對不同水深的水樣進行分析；採用顯微鏡計數法對原水中的藻類進行每月例檢，並針對水庫潛在的藻華跡象進行例行巡檢，發現藻華後，一般啟動如下過程：收集浮藻和水樣並清理浮藻——檢測藻類是否為產毒藻——對水樣進行藻毒素分析——進一步實施干預；最新的監測數據顯示，新加坡水庫原水中檢出頻率最高的藻毒素依次為擬柱孢藻毒素、微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR，最大濃度達到1~5 μg/L。由於檢出的藻毒素濃度普遍較低，無短期治理的必要，因此PUB將工作重點放在藻類和藻毒素的中長期削減上，如營養物污染源控制等。

2.1.3

標準制定

根據新加坡環境局頒布的《環境公共健康規程》（Environmental Public Health Regulations），管道飲用水中自由態和細胞結合態微囊藻毒素-LR的總含量須低於1 μg/L，這一標準的考量和大部分國家和地區一樣，是建立在WHO提出的參考濃度的基礎上的；為達到這一標準，微囊藻細胞的濃度須控制在10 000 cells/mL以下。PUB的水質觀測數據表明，當TN:TP大於18，而TP小於0.035 mg/L時，微囊藻的濃度便可控制在10 000 cells/mL以下。同樣基於WHO在2003年發布的標準，新加坡規定，在和人體有直接接觸的娛樂用水的水體環境中，葉綠素a的濃度必須低於50 μg/L；高於此濃度時，水中很有可能會存在藻類毒素，威脅人體健康和生態安全。

2.1.4

科研技術

為提高藻類控制和水質監測的效率，更好地應對藍藻爆發危機，PUB也投入了大量精力在相關的科研攻關和技術開發上。PUB主導或參與的科研項目有：

（1）採用PCR技術建立方法來監測產毒藍藻，並應用該方法考察新加坡10座水庫中5種毒性藍藻的存在水平，以及確認其中優勢藍藻的種類。結果表明銅綠微囊藻（M. aeruginosa）和擬柱孢藻（C. raciborskii）分別是新加坡水庫中微囊藻毒素和擬柱孢藻毒素最主要的產生藍藻。根據該研究結果，PUB自2009年起將擬柱孢藻毒素也納入常規監測的範圍。

（2）研究產毒藍藻在新加坡水庫中的空間和時間分布、它們的產毒素率速率以及對環境因子變化的反應。結果表明，新加坡水庫中超過70%的微囊藻可以產生微囊藻毒素（MC-LR和MC-RR），或含有相應的產毒基因；有兩種擬柱孢藻株可以產生擬柱孢藻毒素。營養物質（N、P等）對藻類的生長影響重大；氣候變暖可能不會影響藻類的生長，但會影響藻類的產毒素率；光照的影響較小。

（3）研發或引進先進的技術設備，並進行實證和投入應用，包括各種在線自動監測設備、新型智能水評估網路（New Smart Water Assessment Network）、水下無人駕駛車（Autonomous Underwater Vehicle）、超光譜成像技術（Hyper Spectral Imaging）、手持式光譜儀（Water Inside Spectrometer）等。

（4）研究超聲技術控藻。超聲系統發出特定頻率和能量的超聲波，在水庫表層形成超聲壓力，迫使藻類下沉，防治其上升至水層表面進行光和作用；同時超聲波也能在保持藻細胞壁完好的情況下，破壞其細胞內部結構，甚至能產生自由基來氧化藻細胞。超聲裝置如圖5所示。

圖5 超聲控藻系統

2.2

建議更新加拿大微囊藻毒素指導標準

Lo等對LC-MS/MS方法和ELISA方法對於微囊藻毒素的檢測進行了比較，並根據研究建議，加拿大現有的飲用水微囊藻毒素濃度標準需有所改進。

基於以往的技術限制，飲用水中微囊藻毒素的官方檢測方法（安大略環境署，MOE）為LC-MS/MS；而在微囊藻毒素的90多種變體（variants）中，檢測的項目只有「微囊藻毒素-LR」，濃度限值為1.5 μg/L。事實上隨著技術的發展，更加便捷高效的ELISA技術已逐步被MOE採用，用於飲用水和地表水中微囊藻毒素的檢測。由於ELISA技術只能檢測會和抗體發生免疫交叉反應的所有抗原（微囊藻毒素），不能定量檢測某單一抗原（微囊藻毒素-LR），因此現有的《安大略飲用水水質標準規範》（Ontario Drinking-Water Quality Standards Regulation，O. Reg. 169/03）需要有所調整，從只檢測微囊藻毒素-LR的濃度到檢測微囊藻毒素所有90多種變體的總濃度，以減輕當前對於LC-MS/MS方法的政策依賴。

在一項長達3年的研究中，Lo等採集了849個水樣（包括地表水、原水和處理後飲用水），對其中的微囊藻毒素分別用ELISA方法和LC-MS/MS方法進行平行測定，比較兩種方法的結果，總結如表3所示。Tukey-lambda概率曲線的相關係數顯示，ELISA和LC-MS/MS的數據樣本總集符合柯西分布，兩者之間並不顯著相關（p

表3 ELISA和LC-MS/MS的比較

根據用戶友好、靈敏度、可靠性、檢測周期、成本、使用門檻等因素綜合考量，採用ELISA作為檢測微囊藻毒素的首選方法，LC-MS/MS作為補充方法，是較為科學準確的檢測手段。因此Lo等建議改用ELISA作為加拿大飲用水標準中微囊藻毒素的檢測方法，而標準中的「微囊藻毒素-LR濃度」也應改為「微囊藻毒素濃度」，以更加科學全面地反映水中微囊藻毒素的存在水平。

3

結語

湖泊水庫中藍藻和藍藻毒素的有效監測和管理，對於防止大規模的藍藻爆發，以及下游水廠及時調整工藝以提高飲用水中藍藻毒素的去除效果，具有重要意義。隨著檢測手段的發展與進步，更加高效便捷的ELISA、熒光檢測、qPCR等技術在藍藻的實時監測中得到了越來越廣泛的應用。而新技術的進一步推廣和使用，還需要對實際應用場景中可能會面臨的問題進行進一步的研究和論證，如方法的可靠性、在不同水體環境中的適用性、各種環境因素的干擾、技術成本等。與此同時，相關的管理手段也應不斷更新和完善，在現有的框架體系中及時引入和發展新的技術手段和管理內容，建立和健全高效的藍藻預警機制、藍藻和藍藻毒素的水質檢測標準等。

推薦參考

曹徐齊,阮辰旼.湖泊水庫中藍藻及藍藻毒素的監測技術和管理策略——「第四屆國際水協湖泊與水庫管理研討會」成果彙編一[J].凈水技術,2017,36(8):5-12.

Cao X, Ruan C. Monitoring technologies and management strategies of cyanobacteria and cyanotoxins in lakes and reservoirs: Compilation of research findings of 4th IWA Symposium on Lakes and Reservoir, Part I [J]. Water Purification Technology, 2017, 36(8):5-12

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