技術方法｜膠質母細胞瘤病理取材方式-七分法取材

膠質母細胞瘤病理取材方式-七分法取材

膠質母細胞瘤病理取材方式-七分法取材

俞磊, 漆松濤, 易國仲, 李志勇

摘要：目的 規範膠質母細胞瘤（GBM）的病理取材方式，為臨床提供更為準確的病理信息。方法 我們規範GBM病理取材方式為「七分法取材」，即由術者在術中對GBM瘤塊的「中心、前方、後方、內測、外側、上方、下方」共7個位置進行取材。本研究共納入了40例經「七分法取材」的GBM患者，我們分別對各個位置取材的腫瘤組織進行原代細胞培養，免疫組化檢測7個位置取材組織的IDH1蛋白、MGMT蛋白的表達情況。結果 腫瘤中心取材的腫瘤組織100%培養出了腫瘤細胞，細胞呈長梭形、遷移快、增殖較塊；T1增強像以外其他位置取材的腫瘤組織原代細胞培養成功率為60%，細胞呈圓鈍形、遷移慢、增殖慢，兩種細胞在細胞形態、細胞學功能上存在明顯差異。IDH1蛋白在7個位置表達情況存在差異的病例為10例，比例為25%，差異具有統計學意義（P=0.001）；MGMT蛋白在7個位置表達存在差異的病例為12例，佔比為30%，差異具有統計學意義（P=0.004）。結論 7個位置取材的組織中均可培養出腫瘤細胞，並且IDH1及MGMT蛋白的表達也存在差異。中心取材的腫瘤組織雖能準確反映腫瘤的病理學級別，但是考慮到GBM高度異質性故需綜合考慮其他位置取材的組織病理及分子病理特徵，才能更準確地反應腫瘤的生物學特性。故七分法取材較傳統的病理取材對GBM的病理診斷更有指導意義。

膠質母細胞瘤（GBM）極強的侵襲性和極大的異質性是直接導致GBM患者預後差的重要原因^[1-2]。由於GBM具備極強的侵襲性，與周邊正常腦組織不存在明顯的界限，再加上多數情況下腫瘤位於功能區或者靠近功能區，故術後腫瘤細胞的殘餘在所難免，這就註定了腫瘤複發^[3-4]。早在2011年就曾提出南方膠質瘤中心的膠質瘤手術切除的理念^[5]。GBM亦是一個異質性極強的惡性腫瘤^[6-7]。故傳統的病理取材不可能代表腫瘤整體的生物學特性，故要求術者在術中應該多點取材，並且將取材位置在影像片上標記（甚至在導航輔助下），而不只是將腫瘤標本切下來後交給病理科醫生按經驗取材。

隨著新版的WHO中樞神經系統腫瘤分型的推出，分子病理學診斷顯得越來越重要，如異檸檬酸脫氫酶（IDH1）、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）、EGFR等蛋白的表達情況，能夠提示GBM患者的預後情況，或可指導臨床上的治療選擇（如靶向藥物選擇等）^[8-9]。由於GBM存在的顯著腫瘤異質性，到底哪一部分腫瘤組織能夠為我們臨床提供最為準確病理信息呢？傳統的病理取材結果是否不夠全面？為此，我們提出由神經外科醫生在術中進行「七分法取材」的方法，旨在能夠得到更為精確的腫瘤病理信息，為臨床治療提供依據以及方向。

1資料與方法

1.1 「七分法取材」方法

術中進行腫瘤組織塊的切除與取材，取材主要為腫瘤中心區域以及腫瘤外周區域（圖1），腫瘤中心區域取材1個點，編號：（1）腫瘤中心；腫瘤外周區域取材6個位置，分別編號為：（2）正前方；（3）正後方；（4）正內測；（5）正外側；（6）正上方；（7）正下方。取材依據如下原則：以人體自然立位時約定前後、上下，靠近中線側為內，反之為外；如有個別為中心性雙側佔位時，以佔位病變體積小者一側為內，體積大者一側為外；對膠質母細胞瘤的「Q、S、T、P」4種不同切除方式所切除的瘤塊（切除分型：Q型切除指將MRI T1增強、T2、FLAIR異常信號區域全切除；S型切除指將MRI T1增強信號區域全切除，T2/FLAIR部分殘留；T型全切除指將MRI T1增強信號區域全切除，而T2/FLAIR較術前可無明顯變化；P型切除指MRI T1增強信號區域仍有明顯殘存^[10]），腫瘤中心區域取材一般為T1增強區域（若中心為壞死組織，則取壞死周邊、離幾何中心最近的部位，若中心為囊變，則取囊變內的實性成分）；周邊區域取材盡量靠近T2/Flair像的邊緣處（Q、S型切除）以及T1增強像的邊緣（T/P型切除）。總共有40例膠質母細胞瘤進行了「七分法取材」，每個位置取材的組織又分為3部分：一部分用於送檢病理診斷；一部分用於原代細胞培養；一部分作為凍存標本組織。病理組織應用於科學研究，患者均已知情並同意。

1.2 原代細胞培養

我們對40例GBM「七分法取材」的腫瘤組織進行原代細胞培養。培養過程均在超凈工作台中進行，將術中「七分法取材」的腫瘤組織用PBS洗凈血液、燒灼的壞死組織等，用剪刀將組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，用0.25%的胰酶消化5~10 min後，1000 r/min離心3 min，將離心沉澱用含10%胎牛血清的完全培養基重懸，鋪於10 cm培養皿中，在37℃、5% CO₂的恆溫培養箱中進行培養，每隔2~3 d更換培養基。

1.3 免疫組化

利用免疫組化的方法，檢測「七分法取材」的7個位置腫瘤組織的IDH1及MGMT蛋白的表達情況。免疫組化使用的抗體為：IDH1（ZM-0447，中杉金橋，稀釋比例：1:50）；MGMT（A0693，Abclonal，稀釋比例：1:100）；二抗購自Abcam。採用DAB顯色液控制顯色，隨機取5個高倍鏡（400×）視野進行觀察。依據表達強弱、陽性細胞百分比進行評分，並由此判斷陽性、陰性表達。評分方法為：（1）表達強弱判斷（陰性表達0分，淺黃色1分，深黃色2分，棕色3分）；（2）陽性細胞百分比（0%為0分；1%~10%為1分；11%~50%為2分；51%~80%為3分；大於80%為4分）；最終得分為兩項評分的乘積，以≥4分為陽性表達^[9]。對「七分法取材」的7個不同位置的組化結果，若七個位置的組化結果存在不同，則記為差異病例。

1.4 統計學分析

採用SPSS 21.0軟體對組化數據進行統計分析，分析方法為：配對四格表資料一致性檢驗，Kappa係數>0.75為一致性良好，以P<0.05為差異有統計學差異。

2結果

2.1 原代細胞培養結果

在40例進行「七分法取材」的GBM組織中，腫瘤中心取材的組織原代培養成功40例，成功率100%；腫瘤周邊區域6個位置取材的腫瘤組織，只要有1個位置的組織培養出腫瘤細胞即視為成功，此組原代培養成功24例，培養成功率為60%。對於「Q」、「S」型切除後的取材，腫瘤中心培養出的腫瘤細胞，細胞形態呈長梭形，具有很長的細胞偽足，能在較短的時間內從組織塊中爬出，細胞遷移能力強、增殖快（圖2A）；從腫瘤周邊區域（取材於T2/FLAIR異常區域）培養出的腫瘤細胞，細胞形態呈圓形，無明顯細胞偽足，增殖明顯慢於腫瘤中心區域培養出的細胞（圖2B）。

2.2 HE染色結果

腫瘤正中心取材的腫瘤組織，HE染色可以見明顯的血管生成、高密度的異型腫瘤細胞、核分裂像多見，呈典型的膠質母細胞瘤的表現；取材於外周T2/FLAIR異常區域的其他6個位置的腫瘤組織，HE染色可見腫瘤細胞散在分布、基本無新生血管，呈現低級別膠質瘤的病理表現（圖3）。

2.3 免疫組化結果

對40例進行「七分法取材」的GBM中心及外周區域共7個位置進行IDH1及MGMT蛋白的免疫組化，只要外周區域取材的6個位置中有1個與中心區域組化結果不一樣，即記為差異病例。對於IDH1蛋白，差異病例數為10例，比例為25%，一致性檢驗Kappa係數為0.5，差異具有統計學意義（P=0.001，圖4A、B）。對於MGMT蛋白，差異病例為12例，佔比為30%，一致性檢驗結果Kappa係數為0.417，差異具有統計學意義（P=0.004，圖4C、D）。

3討論

GBM是由不同分化群瘤細胞組成的異質性腫瘤，在一個瘤體之內可能含有起源於多種細胞的腫瘤組織成分，同時具備極高的侵襲性，能夠沿著白質纖維束、血管等遷移至離腫瘤中心很遠的區域^{[3, 4, 7, 11-14]}。基於屍檢及歷史上的手術活檢，腫瘤細胞可以在影像學異常範圍外很遠的地方出現。腫瘤基因組的不穩定性、腫瘤細胞的異質性和廣泛浸潤性決定了GBM的治療充滿了挑戰。不可否認，手術切除程度是影響GBM患者預後的一個關鍵因素，統計南方醫院神經外科收治的經「Q型切除」輔以術後標準放化療的GBM患者，其中位生存期超過國際上報道的14.6個月^[15]。遺憾的是，即便GBM患者進行了最為積極的治療，雖然一小部分患者可以長期生存^[16-18]，但GBM患者的總體預後仍然較差。實際上腫瘤的異質性對手術後的綜合治療失敗具有決定性影響。GBM不僅具有時間異質性（即不同的時間可能腫瘤的基因型差異亦不同），還具有空間異質性。故針對某一特定區域基因突變的靶向治療是不合適的，然而常規的病理取材（往往只是某一特定區域）並不能對腫瘤所有部位進行取材及驗證突變。這就要求我們探索出一種符合腫瘤異質性的規律的病理取材方法。

本研究中，我們對取材於GBM瘤體不同區域的組織進行原代培養，在腫瘤周邊區域（T2/FLAIR異常區域與正常MRI影像交界區）取材的組織培養出了腫瘤細胞，培養成功率為60%，這也驗證了GBM細胞具有高侵襲性的特性；同時，取材於中心區域和周邊區域所培養出的腫瘤細胞，無論是在細胞形態、細胞生物學功能上都存在極大的差異，這也證明了GBM所存在的腫瘤異質性。IDH1突變型蛋白的陽性表達以及MGMT蛋白的陰性表達均是GBM患者預後良好的標誌，然而，我們同時對取材於不同區域的腫瘤組織進行IDH1、MGMT蛋白的免疫組化，結果發現：40例GBM患者中，有10例患者IDH1蛋白存在表達差異，12例患者MGMT蛋白表達存在差異，進一步證明了GBM瘤體存在極大的異質性。

既然GBM具有極強的異質性那麼到底哪部分腫瘤組織真正代表了腫瘤的生物學特性？結合文獻分析，我們認為腫瘤周邊區域取材的組織更加具有代表性。GBM影像學和病理組織學顯示正常的區域中亦能培養出腫瘤細胞^[14]，這一部分手術無法切除和被放療忽視的腫瘤細胞很可能就是腫瘤複發的真正根源，應該是GBM患者治療的靶細胞^[12]。近些年來文獻中一直強調的「Peritumoral Zone」^[3]。從理論上講，腫瘤組織周邊區域在物理距離上離殘腔周邊的腫瘤細胞更近，更能代表這群殘餘細胞的生物學特性。這也要求外科醫生在手術切除時注重完整整塊手術切除方式和腦溝、腦池等重要解剖結構的辨認，必要時可以在導航下取材，只有這樣才能保證腫瘤取材時在空間位置上的定位準確。

選擇七分法主要原因是：對七分法取材的組織進行HE染色發現，腫瘤中心取材的組織存在更為豐富的血管，腫瘤細胞密度、異型性亦甚於周邊區域取材的組織，因此在腫瘤中心區域取材，用於病理判斷腫瘤的組織學級別更為確切，也有利於和現有的文獻結果相比較；對周邊區域取材的腫瘤組織進行分子病理學的檢測，其檢測結果更能代表術後殘存的腫瘤細胞，對判斷術後GBM患者的預後及治療選擇更有科學；考慮取材的簡便與可行性，我們選擇在上下、前後、內外側總共3個維度、6個位置上進行取材。結合術前影像學資料、術中神經導航、術中術者切除腫瘤時的手感等等，神經外科醫生能夠精確的對腫瘤的任何部位進行取材，這種優勢是傳統取材方法所不具備的。因此我們提出GBM的「七分法取材」的方式，通過神經外科醫生在術中對GBM各個區域進行取材，從而使得術後的病理結果更為完善、真實的反應患者的情況，為神經外科醫生的臨床決策提供更為準確的信息。除了一部分WHO I級的膠質瘤外，所有的膠質瘤均遵循「七分法」病理取材的原則，會為我們提供更多關於腫瘤的組織和分子病理信息，對臨床和科研均具有重要意義。

參考文獻：略

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！