韓春雨，撤稿了！

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生物探索

編者按

8月3日，《自然-生物技術》發布聲明：撤回韓春雨團隊於2016年5月2日發表在該期刊的論文。而韓春雨團隊表示：會繼續調查該研究缺乏可重複性的原因，以提供一個優化的實驗方案。在發表韓春雨等人撤稿說明的同時，該期刊發表了一篇社論指出：是時候該用數據說話了！

北京時間8月3日，《自然-生物技術》（Nature Biotechnology ）發布聲明稱，撤回韓春雨團隊於2016年5月2日發表在該期刊的論文「DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute」。據悉，論文是韓春雨主動申請撤回。

此前，原論文一發表，韓春雨團隊及其報告的NgAgo技術得到了諸多喝彩聲。論文中所描述的NgAgo技術是利用格氏嗜鹽鹼桿菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute核酸內切酶，以DNA為介導進行基因編輯，簡稱NgAgo-gDNA。在論文中，韓春雨團隊使用NgAgo-gDNA技術，在哺乳動物細胞基因組上的47個位點進行了100%的基因編輯，效率為21.3%~41.3%。按照韓春雨團隊的實驗結果，該技術效率之高，能媲美已有「基因魔剪」之稱的CRISPR-Cas9，對基因的特定位點進行準確地剔除、添入等。

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韓春雨撤稿聲明：會繼續調查該研究缺乏可重複性的原因，以提供一個優化的實驗方案

在原論文的最後，《自然-生物技術》附上了韓春雨等人的撤稿聲明。他們表示：「由於科研界一直無法根據我們論文提供的實驗方案重複出論文圖4所示的關鍵結果，我們決定撤回這項研究。在該圖中，我們報告說，利用5′磷酸化單鏈DNA作為引導，NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）能夠有效引起雙鏈斷裂，並對人體細胞基因組進行編輯。雖然許多實驗室都進行了努力（Protein Cell 7,913-915, 2016; Nat. Biotechnol.35, 17-18, 2017; Cell Res.26, 1349-1352, 2016;PLOS One 12, e0177444, 2017) ，但是沒有獨立重複出這些結果的報告。因此，我們現在撤回我們的最初報告，以維護科學記錄的完整性。不過，我們會繼續調查該研究缺乏可重複性的原因，以提供一個優化的實驗方案」。

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《自然-生物技術》社論：是時候該用數據說話了！

一項宣稱通過Argonaute酶實現基因編輯的研究被撤回，這顯示了論文發表後的同行評議在全天候媒體（24/7）時代的重要性。

本期，韓春雨及同事撤回了發表於去年5月的一篇論文。該論文稱，短5′磷酸化單鏈DNA（short 5′ phosphorylated single-stranded DNAs）可引導格氏嗜鹽鹼桿菌核酸內切酶（Natronobacterium gregoryiArgonaute，簡稱NgAgo）產生雙鏈斷裂，實現對人類基因組的編輯（詳見：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute）。論文一發表，便引起科研人員的極大興趣和媒體的競相報道。但是很快，在Twitter、博客和其它社交媒體的助燃之下，有關該研究可重複性的質疑開始迅速增多。去年11月，本刊發表了「編輯部關注」（Editorial Expression of Concern），提醒科研界留意這些可重複性方面的擔憂。為了最終解決這個爭議，多個研究小組在幾個月里生成了更多的實驗數據。如今塵埃落定，這也是世界各地的許多實驗室為澄清NgAgo的功能而付出的大量時間、精力和資金的證明。

韓春雨的這篇論文自去年發表後所產生的影響力，再怎麼誇張地說也不為過，尤其是在論文的來源地中國。中國媒體紛紛進行報道，以大標題宣告一項全新基因編輯系統的發現。這無疑是一篇中國去年被報道最多的論文；媒體監測公司融文諮詢（Meltwater）的數據顯示，僅在論文發表後的最初兩個月里，就有將近4000篇相關的中文新聞報道。

NgAgo的轟動之處集中在它有可能補充，甚至取代CRISPR/Cas9基因編輯系統之一點上。NgAgo有望以一個目標序列進行基因編輯（Cas9不僅需要目標序列，還需要另外一個附近的識別（PAM）序列）。而且，初始數據還顯示了它在其它方面的優勢，如引物的穩定性更強（DNA相對於Cas9採用的RNA），增強特異性，減少基因組編輯脫靶，改善在基因組富含GC區域的活性，以及使所用的試劑更易於合成和處理。

如果說這一切都聽上去太過美好而令人難以置信，那麼去年夏天以來，隨著越來越多的實驗室無法重複該論文所報告的基因組編輯功能，質疑聲便開始出現了。在各種基因組編輯會議上，在新聞討論組和電子郵件中，這篇論文成為最熱話題之一。這很快便引起媒體注意，有關該初始報告有效性的正反兩方面的聲音開始交鋒。我們內部的圖像完整性篩查沒有發現韓春雨論文的明顯異常，複查數據的三位外部評審人也持相同觀點。

在此期間，《自然-生物技術》一直與科研界保持聯絡，關注各種為重複論文所做的持續努力。最終，在編輯們的協調下，三個獨立小組的成果形成了一篇單獨的反駁性論文，並通過了同行評議（Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute，見Nat. Biotechnol.34, 768–773, 2016）。有了這些數據，我們就有充分的理由去提醒讀者留意該論文可能存在問題，我們將正式的「編輯部關注」發表在該篇論文所在的網址上，此舉得到包括韓春雨在內的兩位論文作者的支持。

我們也詢問了論文作者是否可以解答科研界為何難以重複他們的結果。於是，去年12月，韓春雨及同事，還有另外幾個與本刊聯繫的獨立研究小組，提供了新的數據，稱已經重複了NgAgo基因編輯活性。當時，本刊編輯和一位外部評審人都判定這些數據太過初級，不滿足發表標準。因此，我們決定給這些原始論文作者和新的研究小組更多時間來收集更多的能支持其論點的實驗證據。

現在，距原論文發表已過去了一年多，我們了解到當初曾報告說初步成功重複出實驗結果的獨立研究小組，無法強化初始數據，使其達到可發表的水平。類似的，在徵求專家評審人的反饋意見後，我們判定韓春雨及同事提供的最新數據不足以反駁大量與其初始發現相悖的證據。我們現在確信韓春雨的撤稿決定是維護已發表科研記錄完整性的最好做法。

這篇有關NgAgo的論文發表出來，並不是科研過程的結束，而是開始。與任何其它發表出來的報告一樣，正是廣大的科研共同體對相關方法進行了檢驗，識別潛在的錯誤來源，驗證試劑並優化試驗。在本例中，有多位敬業的研究者個人對已發表實驗方法的各種細節進行檢驗，並完成記錄翔實和有對照組的反駁性研究 （Questions about NgAgo，見Protein Cell 7, 913, 2016；NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish，見Cell Res. 26, 1349–1352, 2016；No evidence of genome editing activity from Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) in human cells，見PLoS One, 12, e0177444, 2017）。

這篇NgAgo論文也顯示了社交媒體的利與弊。顯然，這些平台對於迅速提醒廣大科學界留意該論文可能存在的問題發揮了重要作用。但是，它們也抬高了人們的預期，以為有關這篇論文的問題是直截了當，可以快速解決的。然而，關於NgAgo的各種問題是無法在幾個星期或幾個月內就能澄清的，這是有原因的。即使是簡單的實驗也需要花費數周來準備、實施、分析和解決出現的問題。另外於事無益的是，那些進行可重複性研究的人，其付出的努力往往得不到回報——這樣的工作單調乏味，沒有資金支持，還吃力不討好。

難怪在希望得到快速、明確答案的全天候媒體和公眾眼中，論文發表後的同行評議流程似乎慢得讓人沮喪。但是，當涉及生物學時，往往沒有明確的答案。當研究重複性時，有一點我們是知道的，那就是這需要花時間來做。就這篇有關NgAgo的論文而言，現在是時候了，數據已經說話了。

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NgAgo論文事情始末回顧

2016年5月2日

河北科技大學副教授韓春雨課題組在國際頂級期刊《自然-生物技術》上發表了NgAgo基因編輯技術的論文，描述NgAgo（格氏嗜鹽鹼桿菌的核酸內切酶）編輯基因有效，而且與Cas9-sgRNA在切割哺乳動物基因組DYRK1A位點的效率上可以媲美。

7月21日

中科院神經所研究員仇子龍發表聲明，稱能在基因組水平看到NgAgo引起的基因編輯，並呼籲韓春雨儘快發布NgAgo 2.0版和Smart版。這是韓春雨之外迄今唯一實名宣布加入NgAgo和ssDNA後可以看到基因編輯的研究組。

7月29日

澳大利亞國立大學GaetanBurgio教授發表長文表示無法重複韓春雨團隊的實驗結果。隨後，美國、西班牙等多位科學家也表示，無法重複韓春雨NgA系統的基因組編輯結果。

8月8日

《自然》雜誌網站發表一篇報道，詳細記述了多國科學家對於韓春雨的NgAgo的爭論。文章指出，來自澳大利亞、西班牙等國的科研人員表示實驗不可重複。

10月10日

12位學者站了出來，決定實名公開他們「重複」韓春雨實驗方法的結果：「陰性的」、「不工作」等等。這樣結論的通俗表達即是，他們沒能「重複」出韓春雨的實驗，其實驗方法「讓人懷疑」。

10月12日

北京大學饒毅教授及中科院院士邵峰通過《知識分子》聯合發文，公開與河北科技大學校長的信件，他們在信中建議各方包括河北科技大學謹慎對待韓春雨及其研究成果。

10月14日

河北科技大學就韓春雨實驗結果受質疑作出書面回應稱：已有機構用韓春雨團隊技術實現基因編輯，具體信息會適時向社會公布。

11月15日

由國內外二十家實驗室負責人聯名撰寫的一篇名為「Questions about NgAgo」的學術論文在Protein Cell雜誌上發表（Burgess et al., 2016），首次公開以公開發表學術論文的形式提出無法重複韓春雨的NgAgo實驗。

11月29日

《自然-生物技術》發布最新聲明，就此前發表的韓春雨等所著論文《利用NgAgo進行DNA引導的基因編輯》發表了「編輯部關切」，並發表Toni Cathomen及同事的通信文章，或將否定韓春雨原論文所稱的有效編輯內源性基因的這一主要發現。

2017年1月9日

國家知識產權局發布 「視為撤回通知書」。顯示以河北科技大學副教授韓春雨、浙江大學基礎醫學院研究員沈嘯為發明人的專利——以Argonaute核酸酶為核心的基因編輯技術，因申請人未在規定期限內答覆國家知識產權局的第一次審查意見通知書，該專利的申請被視為撤回。

1月19日

《自然-生物技術》發布聲明指出，該期刊已獲得有關韓處於實驗可重複性的新數據，需要調查研究這些數據。

1月19日

河北科技大學官網貼出了「河北科技大學基因編輯技術研究中心與諾維信公司簽署合作協議」的文章。次日，諾維信公司發表聲明承認在NgAgo上達成合作。但河北科技大學和諾維信公司都在重複性問題上避而不提，只是分別表示NgAgo在「真菌表達系統」和「生產酶的微生物表達系統」上有潛力。

5月9日

《自然-生物技術》在線發布了一則「編輯部關切」。內容顯示：NBT的編輯注意到了讀者們對韓春雨2016年5月2日在線發表的有關NgAgo論文重複性的擔憂。

8月3日

論文正式撤稿。

4

不能基因編輯的NgAgo，究竟能幹嘛？

儘管韓春雨等人表示會繼續調查該研究缺乏可重複性的原因，以提供一個優化的實驗方案，但這一撤稿無疑是對NgAgo具有基因編輯功能最大的否定。那麼，不能發揮基因編輯作用的NgAgo究竟有什麼作用呢？

在韓春雨團隊關於NgAgo的首篇Nature Biotechnology發表之後，一些關於NgAgo其它功能的論文也得到了很大的關注。

抑制乙肝病毒複製

上個月，發表在Antiviral Research雜誌上題為「NgAgo-gDNA system efficiently suppresses hepatitis B virus replication through accelerating decay of pregenomic RNA」的論文中，來自山東大學等機構的研究人員證實，NgAgo-gDNA系統能夠通過促進pgRNA（pregenomic RNA）的降解有效抑制乙肝病毒的複製。

該研究在結論中稱，這一研究結果首次證明了NgAgo/gDNA在抑制乙肝病毒複製方面的潛力。研究發現，抑制效果明顯與gDNA靶向區域（gDNA targeting region）有關。此外，儘管HBsAg（hepatitis B surface antigen，乙肝表面抗原）、HBeAg（hepatitis B e-antigen，乙型肝炎E抗原）和pgRNA的水平明顯下降，但作者們未能檢測到NgAgo的任何DNA編輯能力。最後，作者們證明，NgAgo/gDNA顯著縮短了乙肝病毒pgRNA的半衰期。他們認為，這些結果為將NgAgo/gDNA系統用於控制病毒感染提供有趣的線索。

切割RNA

今年1月，在生命科學預印本網站BioRxiv上，來自韓國的一個研究小組發表的題為「DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute」的成果指出，NgAgo能作為一種DNA引導的核酸內切酶切割RNA，而不是DNA。這意味著NgAgo或許可以作為「RNA干擾」的一種工具發揮作用。

基因敲低

去年11月，發表在Cell Research 雜誌上題為「 NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish」的論文中，南通大學神經再生重點實驗室副教授劉東團隊觀察到，NgAgo 確實可以改變斑馬魚的表型，但這並非是通過基因編輯實現的。團隊通過實驗得出結論，NgAgo 系統可以在不改變目標基因序列的情況下，對基因表達實現 knockdown（即下調其目標 mRNA 表達水平），且這可能與 NgAgo 的基因剪切活性沒有關係。

備註：本文部分內容參考自澎湃新聞等。

End

參考資料：1）Time for the data to speak

2）DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute

3）Questions about NgAgo

4）NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish

5）No evidence of genome editing activity from Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) in human cells

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