百年驗證，可行！溶瘤病毒登上「抗癌舞台」，是癌症免疫療法

生物探索

編者按

2006年，中國批准世界首個溶瘤病毒上市；2015年，安進腫瘤疫苗T-Vec成為美國FDA批准的首個溶瘤病毒療法。經過一百多年的努力，溶瘤病毒這一「老概念」終於有了「新生命」。本專題回顧了這類「以毒攻毒」的療法登上「抗癌舞台」的歷程，同時分析了開發這類癌症免疫療法所面臨的獨特挑戰。

自1991年《科學》雜誌報道了第一個基因工程的溶瘤病毒（Oncolytic viruses）以來，經過二十多年的發展，這類抗癌新療法已經邁入了新的發展時期。2006年，中國批准了世界上第一個溶瘤病毒（重組人5型腺病毒H101）上市，用於治療晚期鼻咽癌。2015年，安進公司用於治療晚期黑色素瘤的腫瘤疫苗T-Vec正式獲批，成為美國FDA批准的首個溶瘤病毒療法。

T-Vec的上市進一步證實了溶瘤病毒作為抗癌療法的可行性，同時也「喚醒」了這一領域的發展，使得投資企業和製藥公司對這類療法的興趣和投入迎來了「高潮」。報告顯示，2016年，對溶瘤病毒公司的總風險投資和私人投資比2010年高出近17倍。

本專題，探索君帶大家一起回顧溶瘤病毒發展的「百年歷史」，同時為大家解析這一「以毒攻毒」療法的抗癌機制、最新研發現狀、獨特的開發挑戰、需要解決的應用難題。此外，專題還特別跟蹤了此前備受矚目的、由我國中山大學顏光美教授研究組提出的M1病毒的最新進展。

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百年驗證「以毒攻毒」

圖1 ：病毒進入癌細胞的機制（圖片來源：Nature Reviews Drug Discovery）

根據維基百科的定義，溶瘤病毒是一類能夠優先感染和殺死癌細胞的病毒。事實上，用病毒來治療癌症並不是新鮮的想法。溶瘤病毒的發展大致經歷了3個階段：

溶瘤病毒開發的第一個階段主要是直接使用野生病毒進行研究。100多年以前，有醫生在臨床上觀察到偶然的病毒感染使得腫瘤消失的現象。這使得人們開始猜想，是否病毒感染能夠用來對抗癌症。於是，開始有醫生直接往癌症患者體內打活體病毒。一個個失敗的案例證明，所謂「以毒攻毒」的抗癌策略並沒有想像的那麼簡單。

隨後，到上世紀中期，一些主動的臨床試驗用各種野生的病毒感染來治療腫瘤並觀察到一定的療效。但是這類早期的溶瘤病毒通常只能產生短期的溶瘤效應，而且不可避免地具有野生病毒感染造成的毒副反應。短期的溶瘤效應可能是限於野生病毒的毒性：臨床使用的病毒滴度比較低；因此，病毒還沒有來得及有效地溶瘤就被病人的免疫系統清除了，其結果是殘餘的腫瘤很快又長了回來。

溶瘤病毒開發的第二個階段始於上世紀90年代；受益於分子病毒學的發展，人們開始能夠選擇性地改造野生病毒的基因組，使之特異性地在腫瘤內複製。在過去20幾年裡，有許多類似的溶瘤病毒進入了臨床試驗，但是絕大部分都由於缺乏顯著療效而在臨床I/II期失敗了。但值得一提的是，在近百個溶瘤病毒的臨床研究中，沒有發現一例因病毒而引起的嚴重毒副反應。因此，儘管在這個階段未能有真正的溶瘤病毒新葯脫穎而出，溶瘤病毒的安全性卻得到了充分的承認。

溶瘤病毒開發的第三個階段主要從本世紀開始，其特點是讓溶瘤病毒攜帶各種外源性基因以增強其療效。目前看來，最有效的外源性基因就是免疫刺激基因，例如GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）。T-VEC獲FDA批准上市證明了這種「改進」的有效性。據悉，T-Vec注射到腫瘤組織後可在腫瘤細胞中大量複製並釋放GM-CSF。T-Vec能夠讓細胞溶解或死亡，使腫瘤釋放腫瘤特異性抗原，與GM-CSF共同促進抗腫瘤免疫反應。

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一種癌症免疫療法

溶瘤病毒究竟是如何發揮抗癌作用的呢？越來越多的研究表明，溶瘤病毒不僅會直接破壞腫瘤細胞，還會刺激宿主的抗腫瘤免疫反應。因此，人們也將其視為一種癌症免疫療法。溶瘤病毒感染了腫瘤後產生的免疫反應可以概括為以下幾個方面：

圖2：溶瘤病毒能夠利用癌症免疫逃逸途徑（圖片來源：Nature Reviews Drug Discovery）

圖3：溶瘤病毒誘導的局部和全身抗腫瘤免疫（圖片來源：Nature Reviews Drug Discovery）

首先，病毒對已經在腫瘤內存在的免疫細胞有強烈地刺激作用，能夠極大地改變腫瘤的微環境，使之從一個免疫抑制的環境變成免疫激活的狀態；

第二，病毒感染的腫瘤細胞能夠表達一些所謂的「危險信號」並釋放大量的細胞因子，從而造成腫瘤外的免疫細胞對腫瘤內的大量侵潤；隨後，被激活的非特異性免疫細胞如NK細胞、巨噬細胞等（被病毒吸引來的或原先已經在腫瘤內的）會殺傷和吞噬那些被感染但是尚未裂解或對病毒溶瘤有抵抗的腫瘤細胞，造成除了病毒溶瘤作用之外的第二重細胞殺傷；

第三，被溶瘤病毒裂解的腫瘤細胞釋放的大量腫瘤蛋白被侵潤的樹突細胞和巨噬細胞所吞噬，某些腫瘤特異性抗原可以被這些抗原呈遞細胞表達並誘導T細胞攻擊未被感染的腫瘤細胞，這一個過程與腫瘤疫苗相似，但因為是發生在腫瘤內，因此是一個所謂的「原位免疫」的過程，其結果是造成特異性免疫細胞如CD8+ T細胞引起的第三重腫瘤殺傷。溶瘤病毒造成的原位免疫是使得免疫細胞攻擊遠端或者轉移腫瘤的主要機制，而且在這個過程中形成的免疫記憶可能使機體產生持久的抗腫瘤療效。

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最活躍的研發階段

根據JAMA Oncology上的一篇綜述稱，目前是溶瘤病毒臨床研究最活躍的階段。有多種多樣的病毒已經被作為一種潛在的抗癌療法，包括皰疹病毒（Herpesvirus）、腺病毒（Adenovirus）、牛痘病毒（Vaccinia Virus）、麻疹病毒（Measles Virus）、柯薩基病毒（Coxsackievirus）、脊髓灰質炎病毒（Polio Virus）、逆轉錄酶病毒（Retrovirus）、呼吸道腸道病毒（Reovirus）、細小病毒H1（Parvovirus H1）、水皰性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）、新城疫病毒（Newcastle Disease Virus）。

在這一綜述中，作者們總結了當前臨床試驗中這些不同溶瘤病毒的一些特點，具體見下表：

圖片來源：JAMA Oncology

綜述稱，根據2016年4月1日在clinicaltrials.gov網站的搜索顯示，有約40個用溶瘤病毒治療癌症的臨床試驗正在招募患者（詳見下表）。這些試驗幾乎都是在成人患者中進行的。值得一提的是，大多數的試驗還是早期的、用於劑量發現的、探索性的研究。

圖片來源：JAMA Oncology

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聯合治療大勢所趨

目前的研究結果顯示，溶瘤病毒的療效依然是有限的，但是當其與一種熱門的免疫療法——檢查點抑製劑（如PD-1/L1抗體、CTLA-4抗體等）聯合時，它的效力能夠得到改善。今年3月，發表在Nature Communications雜誌上題為「Rational combination of oncolytic vaccinia virus and PD-L1 blockade works synergistically to enhance therapeutic efficacy」的研究再次證實了這一點。

來自匹茲堡大學的科研人員發現，當他們使用牛痘病毒感染癌細胞後，被病毒激活的免疫系統使得更多的T細胞進入了腫瘤組織。面對T細胞的侵入，癌細胞會產生自我保護機制來逃過免疫攻擊，其中一種主要辦法就是增加PD-L1的表達。科研人員敏銳地意識到，通過這個方法可以將那些原本對PD-1/PD-L1抑製劑不敏感的「冷」腫瘤，變為敏感的「熱」腫瘤。這時再加入PD-1/PD-L1抑製劑就有可能取得疊加的效果。

在一個小鼠結腸癌模型中進行的實驗證實了這一點：單獨使用溶瘤病毒或者PD-L1單抗一周之後，腫瘤的大小減小了一半左右，而兩者聯用能夠使腫瘤減小80%以上，其中超過40%的小鼠體內腫瘤完全消失。此外，兩者聯用能夠延長患癌小鼠的平均生存時間超過一個月。進一步的研究發現，兩種療法聯用顯著地增加了腫瘤特異的CD4和CD8陽性T細胞的數量，併產生了系統性的針對腫瘤的免疫反應。

基於令人鼓舞的臨床前數據，大量的聯合治療臨床研究正在進行中。筆者在ClinicalTrials.gov網站最新的搜索結果中看到了很多關於溶瘤病毒聯合免疫檢查點抑製劑的臨床試驗。其中，首個獲美國FDA批准的溶瘤病毒療法T-Vec也有很多相關試驗正在進行中，包括與PD-1抗體Pembrolizumab聯合治療黑色素瘤、頭頸癌、肉瘤，與PD-1抗體 Nivolumab聯合治療淋巴瘤或難治性非黑素瘤皮膚癌等。

圖片來源：SCIENCE PHOTO LIBRARY

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四大獨特開發挑戰

作為一種新型抗癌療法，溶瘤病毒的開發有著其獨特的挑戰。先前，發表在Nature Reviews Drug Discovery上的一篇綜述將這些挑戰總結為以下幾點：1）需要更實用的臨床試驗設計和終點響應評估標準，2）需要有效的藥效動力學和葯代動力學（PK/PD）試驗，3）存在生物安全問題，4）需要面對非傳統的監管、生產和商業化問題。

臨床試驗設計和響應評估

最近的證據表明，與直接殺死腫瘤細胞相比，免疫介導的抗癌響應可能發生的要慢很多。此外，免疫系統的激活還會導致「假性進展」（pseudoprogression，如，響應可能在腫瘤負擔初始增長後或者新病變出現時或出現後才被檢測到）。臨床試驗必須考慮到這些非傳統的終點（end point）。它們能夠解釋為什麼會出現延遲的治療響應。儘管假性進展可能會使臨床結果的解釋複雜化，但應該被考慮到未來的溶瘤病毒臨床試驗中。

在臨床試驗設計方面，受試者的資格、劑量以及體內生物分布評估等也面臨著挑戰。到目前為止，病毒的劑量通常是基於可能的最大濃度而定的。很少有研究充分探討了病毒劑量、治療反應和不良事件發生之間的聯繫。

對病毒分布的評估實際上是需要評估病毒遞送的藥效動力學（pharmacodynamics of virus delivery）。理想情況下，這應該包括評估病毒在目標細胞（如癌細胞）中的存在情況、病毒在非目標細胞中的複製情況、潛伏感染的證據、病毒清除、病毒特異性和腫瘤特異性體液和細胞免疫反應（virus-specific and tumour-specific humoral and cellular immune responses）等。雖然許多臨床試驗在這一方面取得了一些進展，但仍沒有形成標準的協定。

藥效方面的考慮

溶瘤病毒在很多方面與標準的藥物有所不同。首先，它們是活的病毒，臨床給葯後會在體內增殖，這會導致有效劑量的變化。目前，有關病毒劑量與體內複製潛能以及治療響應關聯的數據很少。因此，臨床前研究和臨床試驗的進一步調查將對建立安全、有效的劑量指南非常重要。

此外，溶瘤病毒會受到宿主抗病毒免疫反應的影響。在這方面，需要考慮的因素很多，包括已存在的中和抗體、病毒特異性記憶T細胞響應、通過血凝素結合使某些病毒失效的潛能以及某些病毒逃避免疫檢測的先天能力。另一方面，許多腫瘤微環境是高度免疫抑制的，這可能會限制宿主的免疫反應。因此，開展進一步的研究來評估先前已存在的抗病毒免疫，以及治療後的免疫響應對更好的理解溶瘤病毒在癌症患者中如何被清除和控制的動力學至關重要。

生物安全性考慮

迄今為止，在許多癌症的臨床試驗中，溶瘤病毒一直保持著相對可接受的安全性。儘管如此，這些病毒的複製潛能所帶來的感染控制問題仍需要被重視。這一綜述提出要為衛生保健工作者，尤其是準備這類藥物的藥劑師以及使用這類藥物的醫生或護士建立一套指導方針。此外，許多溶瘤病毒包含重組DNA片段，這些DNA片段可能帶來的問題也需要被考慮到。

監管和商業化問題

活的溶瘤病毒的複製特性使其擁有了獨特的監管和生產問題。對一些病毒來說，它很難產生臨床劑量所需的非常高的滴度。這將是生產方面的一大挑戰。

病毒疫苗為溶瘤病毒的生產和管理提供了模板。美國FDA已經發布了一個題為「Guidance for Industry: Design and Analysis of Shedding Studies for Virus or Bacteria-Based Gene Therapy and Oncolytic Products」的指導性文件草案。其它一些相關的文件包括「European Directorate for the Quality of Medicines including Cell substrates for the production of vaccines for human use」以及「Tests for extraneous agents in viral vaccines for human use」。這些文件為用於溶瘤病毒生產的所有材料和細胞的質量控制測試提供了指導方針。除此之外，還需要進行中間產物、病毒批次以及最終溶瘤病毒效力的檢測。

圖片來源網路

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廣泛應用仍需等待

儘管最新的進展讓我們看到了溶瘤病毒成為患者可選擇的抗癌療法的希望，但這類療法距離真正被廣泛使用依然面臨著一些需要克服的困難：

第一，由於溶瘤病毒是活的病毒，與所有其它生物或者小分子藥物都不同，臨床醫生需要首先得到充分的訓練才會習慣使用這類藥物來治療病人，這將增加此類藥物在臨床推廣的難度。

第二，由於溶瘤病毒目前主要是瘤內注射，對於非體表的腫瘤，操作上不如傳統的靜脈注射方便。目前也有一些溶瘤病毒試圖使用靜脈內給葯，但是其療效還待觀察。如果臨床證明靜脈注射的病毒具有同樣的療效，將大大推進該領域的進展。

第三，作為一個完全新型的藥物類別，其臨床使用方法和療效的提高還需要時間與經驗的積累，尤其是與其它現有藥物的最佳聯合使用還需要長期的摸索。

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中國科學家成果推薦

中山大學顏光美教授（圖片來源：中山大學）

提起中國的溶瘤病毒研究進展，想必很多人對M1病毒有一定的印象。2014年10月，中山大學顏光美教授課題組在PNAS雜誌發表了關於天然病毒M1具有選擇性抗腫瘤作用的研究成果，引發了社會各界的強烈關注。團隊在小鼠和人體腫瘤組織上進行的實驗顯示，M1對肝癌、結直腸癌、膀胱癌細胞的殺傷作用最明顯，對黑色素瘤、腦癌和前列腺癌等癌細胞也起作用。

更為關鍵的是，實驗團隊找到了M1病毒靶向殺傷癌細胞的特徵物———鋅指抗病毒蛋白(ZAP)。研究顯示，69%肝癌組織、52%結腸癌組織、61%的膀胱癌組織表現出ZAP的低水平。這意味著，若新葯成功研發，病人可以先通過檢測，確定體內癌細胞缺乏ZAP，便可以進行病毒溶瘤治療，提高有效的可能性。

此外，研究進行了兩種病毒感染正常細胞的實驗：一是同一器官的癌細胞和正常組織細胞的對比實驗，二是包括心臟、肝、腸管、血管等7種人體主要器官組織的正常細胞感染M1的實驗，均未發現M1病毒對正常細胞有損傷作用。

現在，距離關於M1病毒的首篇PNAS論文發表已有兩年多的時間。小編整理髮現，這期間，顏光美教授課題組已先後在Molecular Therapy、Human Gene Therapy、Oncotarget、PNAS發表了4篇與M1病毒相關的新成果。以下是這些新成果簡介：

Molecular Therapy

發表時間：2015年10月13日

論文題目：Activation of Cyclic Adenosine Monophosphate Pathway Increases the Sensitivity of Cancer Cells to the Oncolytic Virus M1

成果簡介：研究發現，激活腺苷酸單磷酸（cAMP）信號通路能增加腫瘤細胞對M1病毒的敏感性。

Hman Gene Therapy

發表時間：2016年6月13日

論文題目：Naturally Existing Oncolytic Virus M1 Is Nonpathogenic for the Nonhuman Primates After Multiple Rounds of Repeated Intravenous Injections

成果簡介：研究在非人靈長類動物上驗證了M1病毒的安全性，發現在食蟹猴上經靜脈多輪重複注射M1病毒後，並未出現任何臨床、生化、免疫學或其它病理學毒性。證明靜脈注射M1病毒的安全性，為後續的臨床試驗提供了可靠的證據。

Oncotarget

發表時間：2016年6月27日

論文題目：A classical PKA inhibitor increases the oncolytic effect of M1 virus via activation of exchange protein directly activated by cAMP 1

成果簡介：研究發現，一種經典的PKA抑製劑能通過激活下游Epac分子增強M1病毒的溶瘤效應。

PNAS

發表時間：2017年6月27日

論文題目：Selective replication of oncolytic virus M1 results in a bystander killing effect that is potentiated by Smac mimetics

成果簡介：研究發現第二線粒體衍生caspase激活因子類似物（second mitochondria-derived activator of caspases (Smac) mimetic compounds， SMCs）能增強M1病毒在難感染腫瘤細胞中的溶瘤效應。細胞和動物實驗表明，SMCs和M1病毒的聯合能顯著殺傷腫瘤細胞並抑制腫瘤生長，正常細胞和組織則不受影響。此外，課題組還使用臨床標本離體活組織培養模型進一步證實了上述聯合應用的有效性。

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總結

一百多年的嘗試和努力使溶瘤病毒這一「老概念」終於有了「新生命」。除了作為單葯，溶瘤病毒聯合化療、放療和其它免疫療法的組合用藥策略也在被進一步研究中。未來，這一領域的挑戰將是成功鑒定出對患者最有效的溶瘤病毒療法，尤其是那些對其它療法有耐藥性的腫瘤患者。我們希望，在科學進步的推動下，溶瘤病毒能夠成為挽救患者生命的一種新途徑。

本文部分內容參考自葯明康德、李治中科學網博客、南方都市報、Virologica Sinica（中國病毒學雜誌）。

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參考資料：1）Global Oncolytic Virus Therapy Market & Pipeline Outlook 2022

2）The Oncolytic Virus Landscape 2017: an analysis of pipeline, stakeholders, deals, industry trends & opportunities

3）Nature子刊：溶瘤病毒可協同PD-L1抗體抗癌

4）菠蘿：溶瘤病毒 以毒攻毒還是毒上加毒？

5）專訪ViroGin賈為國教授： 乘「免疫療法」之勢，溶瘤病毒將成抗癌新利器

6）JAMA Oncology：Oncolytic Viruses in Cancer TreatmentA Review

7）Nature Reviews Drug Discovery：Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs

8）中山大學顏光美教授專訪：病毒M1究竟走到哪一步？

9）中山大學顏光美團隊PNAS揭示M1病毒誘發腫瘤細胞互殺機制

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