Nature首次揭示m6A調控造血幹細胞命運決定

編者按

中國科學院動物研究所劉峰課題組聯合北京基因組研究所楊運桂課題組，在Nature上發表了題為「m6A modulates haematopoietic stem and progenitor cell specification」（doi: 10.1038/nature23883）的文章，該論文以脊椎動物造血幹細胞為研究對象，利用高通量m6A-Seq、RNA-Seq、YTHDF2-RIP-Seq以及單鹼基解析度的m6A-miCLIP-Seq等技術，首次揭示了m6A mRNA甲基化修飾在脊椎動物造血幹細胞命運決定中的調控機制，豐富了對正常生理狀態下RNA甲基化生物學功能的認識，是該研究領域的重大科研突破。同時，上述成果不僅首次闡釋RNA表觀修飾在血液發育中的關鍵作用，還將為體外誘導擴增造血幹細胞提供理論指導。

Graphical Abstract

背 景

血液系統是維持機體生命活動最重要的系統之一，能夠為機體提供氧氣和營養物質，通過物質交換維持內環境的穩態，同時還為機體提供免疫防禦和保護。血細胞是血液的重要組成成分，所有成熟血細胞都起源於造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)，一群具有自我更新及分化潛能的多能幹細胞。造血幹細胞及各類血細胞產生、發育及成熟的過程稱為造血過程，該過程起始於胚胎髮育早期並貫穿整個生命過程，任一階段出現問題都會導致血液疾病的發生。目前對於惡性血液疾病，如白血病，最常用的方法是造血幹細胞移植，其治療效果很大程度上依賴於移植細胞的質量及數量。因此體外誘導造血幹細胞產生並維持其乾性將成為非常重要的解決辦法。研究體內造血幹細胞的發育過程及其分子調控機制，能夠為體外獲得大量可移植的造血幹細胞提供理論依據。

在脊椎動物中，造血幹細胞最初產生於胚胎期主動脈-性腺-中腎區，由特化的生血內皮通過內皮-造血轉化（EHT）過程生成，隨後向胎肝（小鼠和人）或尾部造血組織（斑馬魚）遷移並進行擴增，向胸腺遷移以便發育為淋系細胞；最後，向骨髓（小鼠和人）或腎髓（斑馬魚）遷移以維持終生造血。經過幾十年的研究與探索，人們對於造血幹細胞的體內發育和體外誘導分化已有了基本的了解，但對整個過程的動態調控機制的認識仍不完善，尤其對於表觀遺傳修飾在脊椎動物造血幹細胞發育過程中的作用更是知之甚少。

m6A（N6-甲基腺嘌呤）是最常見、最豐富的真核生物mRNA轉錄後修飾形式之一。該修飾過程是動態可逆的，由甲基轉移酶複合體（METTL3，WTAP和METTL14組成）、去甲基酶（FTO和ALKBH5）和相應的閱讀器（YTHDF或YTHDC等）協同調控。目前，m6A的生物學功能已備受關注，並成為生命科學熱門研究領域之一。Nature雜誌連續發文報道了m6A在斑馬魚早期發育、果蠅性別決定以及T細胞穩態中的功能。自此，人們對於m6A修飾已經有了初步了解和認識，但是，該修飾的生物學功能以及其作用機制仍有待深入探索和挖掘。本研究團隊前期的合作研究發現並鑒定了斑馬魚中m6A甲基轉移酶複合體及其組分。在此基礎上，合作團隊研究人員進一步探索脊椎動物發育過程中m6A修飾的特點及功能，首次揭示了m6A甲基化修飾在脊椎動物造血幹細胞命運決定中的關鍵作用。

文獻解讀

1.斑馬魚胚胎mRNA的m6A甲基化組分布特點

通過提取並純化斑馬魚不同時期胚胎的mRNA，並採用高度靈敏的色譜質譜與多離子反應檢測聯用（ultra-high-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, coupled with multiple-reaction monitoring，UHPLC-MRM-MS/MS）等方法對mRNA中的m6A水平進行檢測，發現在不同時期的胚胎中m6A都有相對較高的水平，這也暗示著m6A修飾在胚胎早期發育過程中發揮著重要作用。隨後，我們提取並純化斑馬魚28 hpf胚胎的mRNA進行meRIP-Seq。通過對m6A分布區域的序列進行分析發現，甲基化修飾位點的序列主要為GGAC（圖1a），這與之前報道的哺乳動物的m6A分布序列高度保守。在mRNA中的m6A主要分布在編碼區（coding sequence，CDS），終止密碼子區（Stop Codon）和3』非翻譯區（3』-Untranslated Regions，3』UTR）（圖1b），這也與之前在哺乳動物細胞中檢測到的分布特點一致。

為進一步探究m6A在斑馬魚胚胎髮育中的功能，我們利用嗎啉代寡聚核苷酸（morpholino, MO）敲低關鍵的甲基轉移酶METTL3的編碼基因mettl3，並對mettl3缺失胚胎進行了MeRIP-Seq。結果發現，在mettl3缺失胚胎中，m6A在5』UTR、CDS和3』UTR區域的分布都有明顯下降（圖1c）。將MeRIP-Seq進行分析並篩選後發現，4,593個基因中的m6A富集程度都有下降（圖1d），我們將其選定為METTL3目標基因。隨後我們對mettl3目標基因的功能聚類進行分析，發現除了之前報道的轉錄和翻譯調控相關的基因條目之外，METTL3目標基因還聚集在胚胎髮育中（圖1e），暗示斑馬魚中的m6A修飾可能會調控胚胎髮育過程。

圖1. 斑馬魚胚胎mRNA的m6A甲基化組

2.m6A甲基化調控斑馬魚造血幹細胞產生

為明確m6A甲基化修飾對胚胎髮育的調控作用，我們首先對mettl3的表達進行了檢測。結果發現，mettl3在血管內皮特異性表達，暗示著METTL3介導的m6A甲基化修飾可能對造血發育過程有調控作用。隨後，我們對造血幹細胞的產生進行了檢測。原位雜交結果顯示造血幹細胞標記基因runx1和cmyb，以及分化的血細胞標記基因gata1（紅系標記基因）、pu1（髓系標記基因）和rag1（淋系標記基因）的表達在mettl3缺失胚胎中有明顯下降（圖2a）。為了進一步研究這些造血表型是否是由於造血幹細胞產生過程受阻，我們利用轉基因魚系Tg(flk1:mCherry;runx1-en-GFP)進行活體觀察，其中GFP熒游標記內源runx1基因的表達，而runx1是造血幹細胞的標記基因，因此在這種轉基因魚中造血幹細胞呈現為GFP+，同時全身血管可以被標記為紅色熒光（mCherry+）。生血內皮同時具有造血幹細胞特性及內皮細胞特性，即呈現出GFP+mCherry+表型（黃色）。結果發現，在mettl3缺失胚胎中生血內皮和新產生的造血幹細胞數目以及胸腺中的T淋巴細胞數目都有顯著下降（圖2b和2c）。同時，通過實時拍攝發現，對照組胚胎的內皮細胞中有一些細胞發生特化形成生血內皮，隨著胚胎髮育，可以觀察到內皮向造血細胞的轉化過程。在此過程中，可以明顯觀察到血管內皮信號（mCherry熒光強度）的逐漸減弱，而造血細胞信號（GFP熒光強度）逐漸增強，直至細胞完全轉變成造血幹細胞（mCherry-GFP+）（圖2d）。然而，在mettl3缺失胚胎中卻觀察不到造血幹細胞的產生，只有內皮信號的持續存在（圖2d）。此外動脈內皮細胞的標記基因tbx20、hey2以及ephrinB2a表達在mettl3缺失胚胎中明顯增強（圖2e）。為進一步驗證m6A在造血幹細胞中的作用，我們利用CRISPR-Cas9技術構建了mettl3突變體斑馬魚。對突變體的表型分析，同樣發現造血幹細胞的產生被阻斷。綜上所述，m6A甲基化修飾在內皮造血轉化過程能夠調控內皮細胞和造血幹細胞的命運。

圖2.mettl3的缺失導致造血幹細胞產生缺陷

3.m6A甲基化通過Notch信號通路調控造血幹細胞產生

為深入探索m6A甲基化修飾對造血幹細胞產生的調控機制，我們利用轉基因魚系Tg(kdrl:mCherry;runx1-en-GFP) 分選出對照組和mettl3缺失組胚胎的內皮細胞（flk1+runx1-），進行RNA-Seq。基因表達差異分析發現，METTL3目標基因中分別有462和680個基因在mettl3缺失胚胎中顯著下調和上調（圖3a）。對存在顯著表達差異的基因進行GO分析發現，表達顯著上調的基因有血管發育和信號通路轉導等功能的高度富集（圖3b），這一結果與之前檢測的血管內皮基因表達升高相符。

結合m6A-Seq和RNA-Seq數據分析發現，notch1amRNA中m6A peak數目和富集程度在mettl3缺失胚胎中都有非常顯著的下降，而基因表達有明顯上調（圖3c）。因此，我們把notch1a作為候選靶基因。之前的文章報道，在內皮造血轉化過程中，Notch信號通路能夠通過維持內皮細胞的特性來抑製造血幹細胞的產生，這一作用與我們在mettl3缺失胚胎中觀察到的現象非常類似。因此我們猜測m6A是否可以通過直接對notch1amRNA進行修飾從而通過Notch信號調控內皮細胞及造血幹細胞的命運決定。

首先，我們對m6A是否能直接修飾notch1amRNA進行驗證。m6A-RIP-qPCR結果發現，在mettl3缺失胚胎中，notch1amRNA m6A的富集下降至幾乎檢測不到的程度（圖3d）。這一結果證明了notch1amRNA可以直接被m6A修飾。隨後我們在分選的內皮細胞中，通過qPCR檢測notch1a基因的表達。同RNA-Seq結果一致，notch1a基因的表達在mettl3缺失胚胎中顯著升高（圖3e）。為證明notch1a基因的上調能夠增強Notch信號，我們首先通過Western blot檢測了Notch1蛋白水平的表達，發現在mettl3缺失胚胎中有明顯上調，同時，具有活性的Notch1胞內段（NICD）的蛋白水平也明顯上調（圖3f）。隨後，我們還利用Notch信號的轉基因魚報告系Tg(fli1a:EGFP;tp1-dsRed)來檢測Notch信號的活性。共聚焦熒光顯微鏡觀察結果顯示，Notch信號激活的內皮細胞數目在mettl3缺失胚胎中有顯著上調（圖3g和3h）。為進一步驗證m6A甲基化修飾對內皮細胞和造血幹細胞命運的決定作用是通過Notch信號來介導的，我們利用Notch信號的特異性抑製劑DBZ以及notch1aMO來進行回救實驗。結果發現，在mettl3缺失胚胎中降低的runx1的表達能夠被DBZ處理或notch1aMO回救（圖3i）。以上結果說明過度激活的Notch信號能夠介導mettl3缺失所導致的內皮和造血幹細胞缺陷的表型。

圖3. METTL3介導的m6A修飾通過抑制notch1amRNA來調控造血幹細胞產生

4.m6A甲基化通過YTHDF2介導的mRNA降解直接調控notch1a的表達

接下來我們對m6A抑制notch1a表達的分子機制進行了探索。經過m6A甲基化修飾的mRNA可以被不同的「讀碼器」識別並走向不同的命運，其中YTHDF2能夠介導m6A甲基化mRNA的降解，因此也暗示著其可能在m6A對notch1a的抑制過程中發揮作用。為證明這一猜測，我們首先確認了ythdf2缺失能夠導致造血幹細胞產生缺陷（圖4b和4c）。隨後，我們將已報道的YTHDF2對m6A的識別位點進行突變，通過在細胞內的表達最終得到斑馬魚的YTHDF2-MU突變蛋白（含W445A、W499A和W504A三個點突變）。EMSA實驗結果表明，相比於野生型YTHDF2蛋白，突變YTHDF2喪失了對m6A的識別及結合能力（圖4a）。同時，在ythdf2缺失胚胎中的造血幹細胞缺陷表型可以被ythdf2mRNA過表達回救，但是不能被ythdf2-mumRNA過表達回救（圖4b和4c）。以上結果說明YTHDF2對造血幹細胞的調控作用依賴於其對m6A的識別。

為進一步證明YTHDF2對m6A所修飾目標基因的調控作用，我們進行了YTHDF2-RIP-Seq。結果發現在YTHDF2結合的RNA中有72.3%的基因同樣能夠被m6A修飾，進一步說明YTHDF2對m6A修飾RNA的特異性結合。隨後我們從對照組和ythdf2缺失組Tg(kdrl:mCherry;runx1-en-GFP)胚胎中分選出內皮細胞並對其進行深度轉錄組測序。相關性分析發現，在m6A和YTHDF2共同的靶基因中，有包括notch1a在內的472個基因在mettl3和ythdf2缺失的胚胎中表達都有上調，說明它們是m6A和YTHDF2的共同目標基因。GO分析發現這些表達上調的基因主要富集在信號通路和血管發育中（圖4d），這與我們之前對m6A靶基因的分析結果一致。接下來我們分析了YTHDF2對notch1amRNA的結合。結果發現在m6A結合的位置也有YTHDF2的結合，而且RNA-Seq也發現notch1a在ythdf2缺失的胚胎中表達明顯上調（圖4e）。

為進一步證明YTHDF2對notch1a的調控作用，我們在分選的內皮細胞中通過qPCR檢測notch1a基因的表達。同RNA-Seq結果相同，notch1a基因的表達在ythdf2缺失胚胎中顯著升高（圖4f）。同時，Western blot檢測結果顯示Notch1蛋白水平的表達在ythdf2缺失胚胎中有明顯上調（圖4g）。隨後，我們還利用Notch信號的轉基因魚報告系Tg(fli1a:EGFP;tp1-dsRed)來檢測Notch信號的活性。共聚焦熒光顯微鏡觀察結果顯示，Notch信號激活的內皮細胞數目在ythdf2缺失胚胎中有顯著上調（圖4h和4i）。為闡明YTHDF2調控notch1a表達是否是通過其介導的mRNA降解途徑，我們利用轉錄抑製劑actinomycin D從24 hpf開始處理對照組和ythdf2缺失組胚胎，並分別在處理後4小時、8小時提取RNA進行qPCR檢測。結果顯示，相比於對照組中actinomycin D處理後notch1mRNA的快速降解，我們發現在mettl3或ythdf2缺失胚胎中，notch1amRNA在actinomycin D處理後能夠維持較高水平（圖4j）。為進一步闡明YTHDF2對notch1mRNA穩定性的調控依賴於其特定位點的m6A甲基化修飾，我們進行了單鹼基解析度的m6A-miCLIP-Seq，並發現notch1amRNA上存在功能性的m6A修飾位點，並可以介導造血幹細胞的表型。由此可知，YTHDF2能夠通過促進mRNA降解來抑制notch1a的表達，進而調控造血幹細胞的產生。

圖4. YTHDF2介導的mRNA穩定性參與m6A對Notch信號的調控

總結

本論文首次在脊椎動物胚胎髮育過程中揭示了m6A依賴的mRNA甲基化修飾特點。與哺乳動物m6A分布特點相似，在斑馬魚胚胎中，m6A 峰傾向於分布在終止密碼子附近的區域，而且m6A 修飾位點序列也是保守的RGACH，這些發現也暗示著m6A修飾在脊椎動物中的功能是保守的。隨後，通過功能分析發現，m6A修飾的基因在胚胎髮育調控這一功能中有高度富集，體內研究發現其在造血幹細胞產生過程中非常關鍵，能夠調控造血幹細胞的命運決定。進一步的機制探索證明，YTHDF2可以識別並結合m6A修飾的notch1amRNA並促進其降解，因此能夠在內皮-造血轉化過程中抑制內皮細胞的特性，從而保證造血幹細胞的命運決定。該研究豐富了人們對m6A mRNA甲基化在正常生理狀態下生物學功能的認識，是該研究領域的重大科研突破。同時，上述成果不僅首次闡釋RNA的表觀修飾在血液發育中的關鍵作用，還將為體外誘導擴增造血幹細胞提供理論指導。

作者簡介

劉峰研究員簡介

劉峰，博士，中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室研究員，「百人計劃」引進人才，「國家傑出青年科學基金」獲得者，科技部「中青年科技創新領軍人才」。1999年畢業於中國科學院遺傳研究所，獲分子遺傳學博士學位；2000年至2008年在新加坡分子農業生物學研究院、美國范德堡大學醫學院和英國牛津大學分子醫學研究所利用斑馬魚和非洲爪蟾從事造血幹細胞的基礎研究。2009年回國後，劉峰博士帶領的血液與心血管發育研究組以斑馬魚和小鼠為模型，研究血液系統發育的分子機制，重點關注血液與心血管幹細胞/前體細胞的形成、造血幹細胞命運決定、維持及分化等。近年來，以通訊作者在Nature、Dev Cell、PNAS、JEM、EMBO J、Blood、Nat Commun、Cell Res和Development等雜誌發表論文20餘篇。課題組承擔了科技部、國家自然科學基金委以及中國科學院等一系列重大課題。與此同時，劉峰博士還擔任國際斑馬魚學會執行委員、中國動物學會斑馬魚分會會長以及中國動物學會發育生物學專業委員會副主任委員兼任秘書長等。

楊運桂研究員簡介

楊運桂，博士，中國科學院特聘研究員，國家傑出青年科學基金，科技部中青年科技創新領軍人才及中國科學院百人計劃終期評估優秀獲得者。1995年本科畢業於復旦大學生命科學學院，2000年博士畢業於中科院上海藥物所/上海生物工程研究中心，分別在法國世界衛生組織國際癌症研究中心（2000-2005年）和英國癌症研究所Clare Hall實驗室（2005-2008年）接受博士後科研訓練。2008年獲聘中國科學院北京基因組研究所百人計劃研究員。研發RNA化學修飾高通量測序和分析技術，研究表觀轉錄組學功能調控規律及其與遺傳性狀表型和疾病關聯機制。技術創新：建立RNA甲基化高通量測序與信息分析技術。理論創新：證明RNA甲基化修飾可逆性及其調控RNA代謝重要功能，和同行拓展了RNA甲基化表觀遺傳學研究新領域。近年來，以通訊作者在Nature、Cell Stem Cell、Molecular Cell、Nature Communications、Cell Research等雜誌發表論文20餘篇。擔任國家自然科學基金委重大計劃『生物大分子動態修飾與化學干預』指導專家組成員，中國生物化學與分子生物學RNA專業委員會副主任等。

張春霞博士簡介

張春霞，本科畢業於東北林業大學，2010年進入中國科學院動物研究所攻讀博士學位，師從劉峰研究員，主要研究方向是造血幹細胞的命運決定。2017年博士畢業後進入哈佛醫學院張毅教授實驗室進行博士後階段的研究。

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