農學篇：轉錄＋代謝聯合分析解析黃瓜揮發性物質的分子機制
自然界中，植物會產生大量的揮發性化合物（VOCs），這些化合物可以保護植物免受各種形式的生物攻擊，並有助於植物適應環境。VOC作為生態信號，是植物化學的重要組成部分，在植物生態系統中發揮核心作用。目前在植物中已發現1700中揮發性化合物。黃瓜是廣泛種植的重要蔬菜作物，直接食用時，以清香口感而受到大家的喜愛。已有研究表明，黃瓜中的揮發性物質Z-3-己烯基乙酸酯和倍半萜烯（E，E）- 法呢烯在黃瓜被蜘蛛蟎和茉莉酸處理時誘導，表明VOC物質可以間接保護植物。但是目前對於黃瓜揮發性物質化合物生物合成及調控的分子機制尚不清楚。
英文題目：Integrative Analyses of Non targeted Volatile Profiling and Transcriptome Data Provide Molecular Insight into VOC Diversity in Cucumber Plants (Cucumis sativus)
中文題目：轉錄+代謝聯合分析解析黃瓜揮發性物質的分子機制
期刊：Plant Physiology，2016，IF=6.4
研究材料：黃瓜
技術平台：GC-MS， RNA-seq，RT-PCR
方案設計：
1）黃瓜栽培種9930選擇23個時間點（4周根，莖，子葉，真葉，12周根，莖，幼葉，老葉，花，子葉，下胚軸，不同發育階段的果實）進行GC-MS的揮發性成分檢測，2-4個生物學重複；
2）黃瓜栽培種9930與代謝物相同時期取樣進行轉錄組檢測，2-4個生物學重複；
3）代謝物與基因相關性分析，尋找組織特異性基因，進行體外蛋白驗證
4）通過酵母雙雜交和免疫印跡法驗證控制揮發性物質底物產生的基因。
23個黃瓜特異組織VOC成分的檢測
為了了解黃瓜揮發性物質的代謝通路，對黃瓜23個特異組織（Fig1）進行揮發性物質檢測。共檢測到了85個揮發性成分，其中22個組分由標準品鑒定，其餘65種成分有資料庫比對得知。PCA結果分析（Fig2A）結果表明，不同發育階段的相同組織分布接近，成熟植物的不同組織差異明顯，相同時期同一組織的生物學重複聚類結果較好。聚類結果顯示，絕大多數VOCs具有組織特異性（Fig2B）。
只有8個VOCs在所有的樣本中檢測出來，這也從側面反映了VOCs的組織特異性。值得注意的是，在成熟的根中單萜類的存在形式為氧化型。
轉錄組數據分析
為了深入了解黃瓜VOCs代謝通路的機制，對23個黃瓜組織進行轉錄組測序。與黃瓜中的VOCs成分具有明顯的組織差異性相比，轉錄組數據表明，只有小部分基因表現出了組織特異性。對轉錄組數據和代謝組數據進行聯合分析，為了避免轉錄組基因（21,788）與VOCs成分（85）量級不同造成的匹配錯誤，選擇比對到催化類別（包含所有代謝物酶基因）的GO（GO：0003824）的9914條轉錄本與VOCs進行聯合分析。候選基因根據VOC s與基因的PCC和對VOC代謝通路的已知信息進行篩選。認為TPS和IDS可能與烯萜類的多樣性相關。
根據取樣的黃瓜組織的VOC分析結果，最初嘗試在分組遺傳水平解釋烯萜多樣性。但是，轉錄組數據中發現，MEP途徑，MVA途徑未發現組織特異性基因。文獻報道，IDS及其下游的TPSs是造成植物萜類化合物骨架多樣性的兩個主要因素。通過查找黃瓜基因組，發現24個TPS基因，分布於1,2,3三條染色體。相對於TPS基因家族來說，IDS數量較少，共有10個。候選基因的表達模式RT-PCR進行了驗證。亞細胞定位實驗顯示，TPS01，TPS11和四種GGPPS蛋白質位於質體。
組織特異性基因描述
RT-PCR驗證了5種黃瓜根組織中特異表達的預測與揮發性烯萜生物合成相關的TPS基因。TPS11，12，14純化蛋白在大腸桿菌中進行驗證，GC-MS酶產物發現，這三種TPS均把GPP催化成單萜，把FPP催化成倍半萜。VOC與轉錄組的相關性分析表明，黃瓜雌花，雄花特異性TPS基因可能參與芳樟醇產生。蛋白驗證發現，TPS01是一種雙功能性基因，以GPP為底物產出芳樟醇，以FPP為底物產生反式橙花叔醇。VOC與轉錄組的相關性分析，預測TPS15是控制黃瓜果實中產生倍半萜的主要基因。蛋白驗證發現，使用FPP作為底物時，TPS15控制合成黃瓜果實里的所有倍半萜（Fig3）
Fig3. 體外蛋白驗證TPS
黃瓜單萜生成的參與
已知涉及單萜生物合成的異聚G（G）PPS酶複合物由大亞基和小亞基組成。黃瓜基因組中包含I型和II型SSU基因CsaSSUI，CsaSSUII。VOC與轉錄組基因相關分析表明CsaSSU I可能參與黃瓜單萜生物合成。用酵母雙雜交和免疫印跡法驗證這些蛋白的相互作用，發現與SSU I或SSU II相關的GGPPS蛋白都形成異聚蛋白複合物。當使用DMAPP和IPP作為底物時，GGPPS1 / SSU I複合物主要顯示GPPS活性。因此，作者得出結論，異聚CsaGGPPS1/CsaSSU I為黃瓜中的單萜生成提供GPP（Fig4）
Fig4.CsaGGPPS和SSU組成的Heteromericgeranyl(geranyl)二磷酸合成酶參與黃瓜單萜生物合成
創新點
1.利用基因組水平的基因表達-揮發物關聯分析的方法，構建了黃瓜揮發性化合物的代謝網路，系統性研究和闡明黃瓜揮發性化合物的生物合成通路和調控的分子機制。
2.體外驗證表明，黃瓜TPS11/TPS14，TPS01和 TPS15可能分別參與了根，花和果實中揮發性萜類化合物的合成，進一步研究發現SSU I 可能在根和花中調控了揮發性單萜前體GPP的合成，從整體上揭示黃瓜揮發性萜類物質多樣性形成的分子基礎。
延伸：
1.代謝組是基因組與表型組的中間橋樑。代謝物的種類和數量在不同品種與組織中存在很大差異，利用這些差異進行遺傳基礎的解析將有助於我們深入了解代謝生物學過程。代謝組作為表型指導基因組及轉錄組的分析，分析結果更直觀，明晰。
2.廣泛靶向代謝組（Widely-targeted metabolome）——創新的高通量代謝組檢測技術。生物體需要產生結構多樣、功能特異的代謝物以抵禦外界多變的環境，其中植物中代謝物多大100多萬種。因此，一種高通量的代謝物檢測技術成為研究代謝組的必備利器。邁維代謝創新了廣靶技術，可以高通量、高靈敏、廣覆蓋檢測不同材料中的代謝物。
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武漢邁特維爾生物科技有限公司（簡稱「邁維代謝」）位於武漢國家生物產業基地--光谷生物城，專註於提供領先的代謝組學技術開發及服務。邁維代謝創新了「廣泛靶向代謝組」技術，基於「代謝組+基因組+轉錄組」技術路線，近年來以通訊作者身份在Nature Genetics、Nature Communications、PNAS、The Plant Cell、Current Opinion in Plant Biology等國際學術期刊發表多篇論文，引領基因組時代的代謝生物學研究新方向。
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