培養條件對乳酸菌發酵劑抗冷凍乾燥性能影響的研究
摘? 要：乳酸菌發酵劑應具有高活力、耐貯藏性以及對不同環境的適應性，特別是在冷凍乾燥過程中活性的保持。本文從乳酸菌發酵劑菌種的內在特性、培養時間、培養基成分、培養溫度及pH值的變化等方面綜述了不同培養條件對乳酸菌發酵劑抗冷凍乾燥性能影響的研究進展。說明乳酸菌在冷凍乾燥中的存活率依賴於它的內在基因，基因差別決定了不同的乳酸菌對冷凍乾燥的抗性存在差異；同時與細胞膜成分以及菌株形態有一定的關聯；通常生長在穩定期的乳酸菌其抗冷凍乾燥能力較強；培養基成分對菌株的影響因菌株不同而異；較低的培養溫度和pH值，有助於提高乳酸菌的抗冷凍乾燥性能。本文為提高乳酸菌的凍干存活率提供一些參考。
關鍵詞：乳酸菌發酵劑；冷凍乾燥；不同培養條件；存活率
近些年來，乳酸菌發酵劑的製備主要依靠冷凍乾燥技術，它被認為是最方便和最成功的方法，但在冷凍乾燥過程中，乳酸菌發酵劑不可避免地會受到冷凍和乾燥帶來的各種損傷，導致菌株存活率降低、活力下降，進而造成生產成本的增加，產品質量不穩定等問題。因此如何提高菌株在冷凍乾燥過程中的存活率是製作高效濃縮型乳酸菌發酵劑的核心技術之一，但由於我國在此項關鍵技術的缺失，導致目前國內乳品企業生產發酵乳製品所採用的乳酸菌發酵劑幾乎全部被國外企業所壟斷。我們從菌種的內在特性、培養條件等方面分析了影響乳酸菌發酵劑抗冷凍乾燥的一些因素，為我國生產擁有自主知識產權的高效濃縮型乳酸菌發酵劑提供一定的理論參考。
1 乳酸菌的內在特性
1.1 遺傳物質
微生物的冷凍乾燥存活率依賴於它的內在基因，這種基因差別決定了不同的乳酸菌對冷凍乾燥的抗性存在差異，有些特定的菌株對冷凍乾燥特別敏感，常常在凍干後喪失了活性。但對大多數乳酸菌而言，對冷凍乾燥未顯示出特別的敏感性。研究表明在冷凍乾燥過程中，細胞內的大分子物質如DNA、RNA及核糖體等將受到影響，這將導致遺傳物質的轉錄、翻譯、DNA的複製以及蛋白質的合成出現問題。
1.2 細胞膜結構
細胞膜中較高含量的不飽和脂肪酸或環丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）有助於增強菌株的抗冷凍能力。不飽和脂肪酸的熔點較低，可以保持菌株在冷凍過程中細胞膜的流動性，從而起到維持細胞膜的功能，增強其抗冷凍性。關於環丙烷化脂肪酸的作用有所爭論：有些人認為同不飽和脂肪酸的作用一樣，體現在增加細胞膜的流動性上，當凍干時其能防止脂肪酸過緊地結合到細胞膜上；也有人認為與順式雙鍵的結構相比，環丙烷的環狀結構會使膜變得僵化，流動性下降，它約束了醯基鏈的移動和失序，從而防止了在冷凍乾燥過程中膜的完整性受到破壞。因此，可通過測定菌株細胞膜中脂肪酸的組成成分及其含量判斷不同菌株的抗冷凍能力。
1.3 菌株形態
研究發現，菌體細胞形態、大小對冷凍乾燥過程中乳酸菌的存活率有一定的影響，如形狀呈小球型的球菌比長桿狀的桿菌對冷凍乾燥具有更強的抵抗力；短棒狀桿菌比長纖細狀桿菌對冷凍乾燥抵抗力強。出現這些現象的原因可能是乳酸菌細胞的表面積越大，在冷凍過程中，形成的冰晶對其細胞膜的機械損傷越大。但對於明串珠菌與保加利亞乳桿菌來說恰恰相反，在相同的凍干條件下，明串珠菌的活力要遠遠低於桿菌的，這說明抗冷凍乾燥性能和菌株間的形態、遺傳物質及細胞膜組成等多種因素密切相關。?
2 培養時間
研究表明，處在不同生長期的菌株對冷凍乾燥的抗性有很大的差別。生產乳酸菌發酵劑最理想的培養時間因具體菌株而異。一般來說，乳酸菌通常生長在對數期末期或穩定期早期，除了考慮在此階段收穫的活菌數最多外，還有一個原因是處在這個時期的菌株在冷凍乾燥過程中其存活率較高。有研究表明，處在幼齡期和老齡期的菌體細胞在冷凍乾燥過程中，死亡率較高，而處在對數生長末期和穩定期前期的菌體細胞其存活率較高。Nagawa等研究發現，對處於穩定期早、末期的長雙歧桿菌進行冷凍乾燥，其處於穩定早期的活菌數是處於後期的100 倍。Bisutti等也得到相似的結論，造成這一現象的原因可能是對數生長末期和穩定前期的菌體細胞生長代謝最旺盛、活力也最強，與其他生長階段的菌體細胞相比，耐受不良環境的能力也要強。進一步的研究顯示，處在穩定期的菌株對冷凍乾燥的抗性要強於對數生長期的。Teixeira等比較了生長在對數期和穩定期的保加利亞乳桿菌對乾燥的抗性，結果顯示，其乾燥後的存活率分別是5.80lg CFU/mL 和7.45lg CFU/mL；Rault等在實驗中證明了保加利亞乳桿菌CFL1處在穩定期的抗冷凍性好於其處於對數期；Louesdon等對長雙歧桿菌RO175的研究也揭示出在穩定期收穫的菌株抗冷凍乾燥性能要明顯好於對數期的。產生這些現象的可能原因有：處在穩定期的菌株因為碳源或其他可利用營養物的耗盡，從而誘導微生物產生應激反應，提高了其對不良環境的抗性；同時在特定環境下，細胞膜脂類成分發生改變，如Velly、Louesdon等證實了與處在對數期的乳酸菌相比，穩定期菌體的細胞膜成分發生了改變，環丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）的含量顯著增加，從而使菌株抗冷凍乾燥性能增強。然而，Palmfeldt等對穩定期早、中、晚期的羅伊氏乳桿菌進行冷凍乾燥，結果發現其存活率沒有明顯的差別；同樣Louesdon等對分別處在對數期和穩定期的布氏乳桿菌R1102進行抗冷凍乾燥存活率的測定，並沒有發現二者存在顯著差異。這些現象的出現可能是由於不同菌株間的差異造成的。以上綜述表明，一般情況下，處在穩定生長期的乳酸菌其抗冷凍乾燥性能要強於其他生長階段，同時也要考慮到菌株間的特異性。
3 培養基成分
人們在早期的研究中關注的是保護劑和不同生長階段對乳酸菌抗冷凍乾燥性能的影響但近來研究發現，乳酸菌在冷凍乾燥過程中的存活率與其生長培養基的成分也有著十分密切的聯繫。
3.1 碳源和氮源
Li Chun等發現與不含葡萄糖的MRS生長培養基相比，添加單糖（果糖、葡萄糖）或雙糖（乳糖、蔗糖）可以明顯提高保加利亞乳桿菌L2的冷凍乾燥生存率；Carvalho等發現當用果糖、乳糖或甘露糖替代MRS培養基中的葡萄糖時，保加利亞乳桿菌具有更好地抗冷凍乾燥性能，其中甘露糖的效果最好；我們實驗室在研究植物乳桿菌LIP的抗冷凍乾燥性能時，分別用果糖、乳糖、蔗糖替代MRS培養基中的葡萄糖，發現蔗糖的效果最好，見下圖1；通過以上實驗驗證合適的碳源可以增強菌株抗冷凍乾燥的能力。
對於細菌的抗冷凍乾燥性能，氮源同樣起到非常重要的作用，Senz等調整MRS培養基的配方，加入一定量的豬源蛋白腖，發現可以明顯改善嗜酸乳桿菌NCFM 抗冷凍乾燥性能；我們實驗室分別選取大豆蛋白腖、酪蛋白腖、胰蛋白腖、酵母粉、牛肉膏、乳清粉等6種物質作為植物乳桿菌LIP生長氮源，結果發現當利用大豆蛋白腖作為其生長氮源時效果最佳，見下圖2；碳水化合物對菌體的保護作用也有可能得益於它具有羥基基團的空間結構，大量的羥基可以代替水分子，通過氫鍵與蛋白質的極性基團結合維持菌體蛋白質的空間結構，防止在冷凍乾燥過程中由於脫水而導致的蛋白質變性。
圖1 不同碳源對植物乳桿菌冷凍乾燥性存活率的影響
圖2 不同氮源對植物乳桿菌冷凍乾燥存活率的影響
3.2 相容性物質
一些研究發現，當乳酸菌在含有特定成分的培養基中生長時，能從生長培養基中吸收些相容性物質，這些相容性物質的存在不影響細胞正常的功能，並能通過調節乳酸菌細胞內的滲透壓來保護細胞膜和蛋白質等成分進而增強菌體的抗冷凍乾燥能力。乳酸菌自身不能合成這些物質，同時它們進入菌體是個耗能過程，需要有糖類等作為能量來源，而冷凍乾燥過程時間太短，不足以使菌體積累這些物質，所以乳酸菌只能從生長培養基中吸收這些相容性物質或它們的前體物質。這些相容性物質通常是一些小的有機化合物，包括一些氨基酸（谷氨酸、脯氨酸等）、季銨鹽（甜菜鹼、肉毒鹼等）和一些糖類（蔗糖、海藻糖等）。Santivarangkna等認為相容性物質的存在，加強了水分子與細胞內生物大分子物質的親和性，從而維持了蛋白質的結構、酶的活性以及細胞膜磷脂的穩定性，進而改善了菌株在冷凍乾燥中的生存率。相容性物質的吸收與培養基的滲透壓有一定的關聯，增加培養基的滲透壓可以促進相容性物質的吸收。
4 培養溫度以及pH值
大量證據表明細胞膜的脂肪酸構成和流動性與生長環境有著一定的關聯性。在乳酸菌培養過程中當發酵條件（如溫度和pH值等）發生改變時，乳酸菌會調整膜中脂類的成分來保障磷脂雙分子層膜的流動性，以便使磷脂雙分子層膜保持在一個理想的狀態，從而維持細胞的正常功能。
4.1 培養溫度
Wang等發現較低的發酵溫度使嗜酸乳桿菌RD758具有更好的抗凍性，與42 ℃的生長溫度相比，當溫度為30 ℃時，在冷凍過程中其存活率較高；其在冷凍貯藏期間發酵溫度為30 ℃或37 ℃較42 ℃的抗凍性更強；由於菌株存在一定的差異性，我們實驗室發現植物乳桿菌LIP在37 ℃時具有更好的抗凍性，見下圖3，以上研究表明，在相對低的溫度下，細胞膜中脫氫酶的活性增加，導致不飽和脂肪酸含量增加，膜的流動性增強。但值得注意的是，細胞膜中較高含量的不飽和脂肪酸容易造成乳酸菌在貯藏期間氧化失活，特別是當水分含量較低時。低溫培養提高抗凍性的另一原因是促進某些乳酸菌菌體多糖的合成。如嗜熱鏈球菌在30 ℃比40 ℃培養時產生的不溶性多糖高2～5 倍，這種物質可提高冷凍乾燥存活率。
圖 3 不同培養溫度對植物乳桿菌冷凍乾燥存活率的影響
4.2 培養pH值
Beal等發現發酵pH值為5.5時，嗜熱鏈球菌有較好的抗冷凍性，對不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例分析發現，較低的pH值可以引起細胞內不飽和脂肪酸的積累。值得注意的是並非所有的菌株都能在低酸或低溫下，其抗冷凍性得到增強。為了研究培養pH值對乳酸菌細胞膜脂肪酸以及抗冷凍乾燥性能的影響，將穩定期的羅伊氏乳桿菌I5007放入pH 6.7的MRS培養中培養6 h後，與對照組（pH 5.7）相比其冷凍存活率從12.95%提高到27.38%；我們實驗室同樣發現當植物乳桿菌LIP生長在初始pH為6.8時其抗凍性更強，活力下降更少，見下圖4，分析發現這與細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例（UFAs/SFAs）的明顯提高有關。
圖 4 不同pH對植物乳桿菌冷凍乾燥存活率的影響
5 結 語
在冷凍乾燥過程中，乳酸菌的存活性受到內在與外在多種因素的影響。從內在因素分析，首先取決於乳酸菌的內在基因，在此基礎上與細胞膜的脂肪酸構成以及細菌的形態有一定的關聯性，總體而言，細胞膜中高含量的不飽和脂肪酸及環丙烷化脂肪酸有助於提高菌體的抗冷凍乾燥能力，形狀呈小球型、短棒狀的乳酸菌抗冷凍乾燥能力略強。對外在的培養條件而言，處在穩定生長期的乳酸菌其抗冷凍乾燥性能要強於其他生長階段；培養基的碳源和氮源對不同菌株的影響各不相同，選擇合適的碳源和氮源可以增強菌株抗冷凍乾燥的能力；添加適量的Ca2＋以及吐溫-80可以增強菌株的抗冷凍乾燥能力；同樣對處在穩定生長期的乳酸菌而言，培養基營養成分的缺失可以增強菌株的抗冷凍乾燥能力；選擇適當的培養溫度和培養pH值，可以提高菌株抗冷凍乾燥性能，對一些乳酸菌來說，在較低溫度、pH值的條件下培養可以提高其抗冷凍乾燥能力。
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