實驗設計不嚴謹，大牛也錯認了RNA甲基化相關酶！

作者：小又

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RNA的m6A修飾最近可謂風頭正盛，隔三差五就有大動作，關於m6A的研究文章如雨後春筍般紛紛冒出。

近期，已有2篇Nature文章分別揭示了m6A修飾在T細胞穩態和造血幹細胞分化中的作用，而cancer cell也刊登了兩篇m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5在癌症中的研究。（回復170915可下載，一周有效）

這些研究成果著實讓人驚喜，但目前我們對m6A的認識依然處於初級階段，不少關於m6A的知識在變著花樣的更新著，因而先前被認定為顛撲不破的真理般的存在紛紛鍾可能被後來的最新研究給打臉。

這不，小又剛進實驗室，就聽說一個非常震驚的消息：FTO和METTL14都不是當年那個去甲基化酶和甲基化酶了！！！（研究RNA甲基化小夥伴們表示一臉懵逼！）

m6A（6-甲基腺嘌呤）是mRNA和非編碼RNA上廣泛存在的修飾，參與RNA剪接，翻譯，穩定性以及通過表觀遺傳學影響特定非編碼RNA的功能。

然而因技術局限，直到2012年，Samie R. Jaffrey和Rechavi研究組發明了MeRIP-Seq技術（即用特異的m6A抗體與含m6A修飾的RNA結合後，進行RNA高通量測序）才可以準確的知道RNA上m6A修飾的數量和具體位置。

同時，參與m6A修飾的酶也陸續被鑒定出來，包括甲基化酶：METTL3/METTL14和去甲基化酶FTO/ALKBH5。（如下圖）

目前，m6A的研究策略主要是通過敲低或過表達m6A相關酶，影響細胞內m6A的整體水平，觀察細胞或個體的生長發育狀態，再通過MeRIP-Seq技術尋找受m6A調控的關鍵基因，因此，對m6A相關酶的鑒定是m6A研究的奠基石。

可誰料，Nature發表 「Reversible methylation of m6Am in the 5』cap controls mRNA stability」和molecular cell發表「Structural Basis for Cooperative Function of Mettl3 and Mettl14 Methyltransferases」的研究成果（下圖），乾脆利落地推翻了FTO和MRTTL14原有的身份！

研究指出，FTO是m6Am（廣泛存在於mRNA的5』UTR的甲基化修飾），而不是m6A的去甲基化酶（正在研究FTO的小夥伴，去關注m6Am吧！），而METTL14本身不具備m6A甲基化酶的活性，但其通過與METTL3結合，仍可影響m6A的水平！

要知道，FTO和METTL14可都是芝加哥大學的何川教授鑒定的！而何川大大絕對是RNA表觀遺傳學界的傑出領導者，包括CNS在內，已經發了超過260篇學術論文，最為同行熟悉的工作就是m6A相關酶的鑒定。

那麼，Nature的這項研究，是怎樣推翻何川大大的研究的？而又是什麼原因導致何川大大得到了「錯誤」的結論呢？究竟以前的結論是如何被推翻的？是學術造假還是實驗設計的失誤？FTO和METTL14相關的研究，得到的結論是否還可行？小又就來和大家詳細解說這場m6A界的相愛相殺。

FTO（ALKBH9）是著名的與肥胖相關的基因，屬於α-KG依賴的雙加氧酶ALK家族的蛋白，但是關於FTO的作用底物，仍是未知的。FTO的結構分析顯示它的底物很可能是單鏈的RNA，那麼具體是RNA上的哪種修飾呢？

之前有報道FTO參與m3T和m3U修飾，但是活性比它的同家族蛋白低很多，所以何川大大靈光一閃，做了一個大膽的假設，FTO的底物會不會是m6A修飾的RNA呢？畢竟m6A可是RNA上最豐富的修飾啊！（文章名：N6-Methyladenosine in nuclear rna is a major substrate of the obesity-associated FTO）

心動不如行動，一個簡單的實驗立馬驗證了何川大大的假設。在0.2nmol的FTO作用下，m6A真的不見了！說明FTO就是m6A的去甲基化酶啊！（下圖）

簡單粗暴還高效！何川大大沒有奇怪過為什麼自己運氣這麼好么。。。接下來的事大家都能想到了，從頭到尾，自始至終都被何川大大遺忘的m6Am逆襲了。

Samie R. Jaffrey等人發現，在低FTO濃度的情況下，FTO對m6Am的活性更強（如下圖），m6A基本不變，而m6Am顯著下降。只有當使用到何川大大當年使用的濃度，即0.2nmol時，FTO才開始影響m6A。

以上均是體外實驗，那麼在細胞內，FTO對誰的活性更強呢？研究者首先發現前人使用的m6A抗體其實無法很好的區分m6Am和m6A，通過方法的改進，他們發現，FTO確實可以在細胞內影響m6Am，而不影響m6A。

那麼m6Am又是什麼，已經在開展FTO研究的小夥伴，該怎樣愉快的繼續開展研究呢？m6Am是mRNA起始的m7G後緊挨著的鹼基（如下圖），所以m6Am修飾全在5』UTR上，研究者發現該修飾與RNA的去帽緊密相關，而去帽是影響RNA穩定性的直接原因之一，所以m6Am的功能主要是提高mRNA的穩定性。小夥伴們不妨考慮自己的研究體系中，FTO的靶向RNA的穩定性的變化。

說完FTO，我們再來聊聊METTL14。如果說有關FTO的研究，何川大大只是運氣不好，當時沒一拍腦門想到是m6Am，而FTO畢竟還真是在高劑量下有m6A的去甲基化酶活性的；那麼有關METTL14的研究，只能說何川大大太不走心了，METTL14一定不是親生的。

鑒定METTL14是m6A甲基化酶的研究，也是何川課題組完成的（文章題目「a mettl3–mettl14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation」），主要基於兩個實驗：

首先，METTL14是已知的m6A甲基化酶METTL3的同源蛋白（這點看名字，我們也發現了），並且在IP實驗中發現與METTL3結合。然後，在細胞內敲低METTL14後，m6A水平顯著下降。end。（下圖）

大家發現了么，竟然沒有做METTL14與RNA結合併單獨發揮甲基化酶功能的實驗。而在細胞內發現的敲低METTL14後m6A的下降，很有可能是由於METTL14與METTL3結合，通過影響METTL3來影響m6A的水平。

果然，在METTL14的結構解析後，前文提到的美國德州西南醫學院的YunsunNam等人發現METTL14根本沒有結合SAM的結構域（發表在molecular cell上，前文有截圖）。

SAM（S-腺苷甲硫氨酸）是各種甲基化酶最主要的甲基供體，進一步研究顯示，METTL14不具備單獨催化m6A的活性。METTL14通過與mettl3結合影響m6A，而不能單獨行使m6A甲基化酶的功能。

真相很簡單，卻值得我們深思，特別是有關METTL14的研究。在課題研究中，小夥伴們有沒有簡單的把相關性等同於因果呢？

敲低METTL14後m6A降低，只能說明METTL14與m6A相關，卻不能因為其與METTL3是同源蛋白，就想當然的認為METTL14也是甲基化酶。大膽假設，小心驗證，希望小夥伴們小心小心再小心。

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