本文將從iPSCs的特性、治療效果、臨床應用面臨的困難及相應對策等方面進行闡述，分析幹細胞治療小梁網退行性病變的本質，並對其應用前景進行探討。

【講座】原發性開角型青光眼的誘導性多能幹細胞治療

朱瑋

266021 青島大學藥學院

通信作者：朱瑋，

Email：wzhu@qdu.edu.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.09.002

【摘要】 青光眼是由視網膜神經節細胞的凋亡導致視覺損失的一類眼科疾病。作為青光眼的主要類型，開角型青光眼的主要致病因素為小梁網凋亡導致的高眼壓。隨著幹細胞的迅速發展，利用幹細胞治療此類小梁網退行性病變成為目前的研究熱點，為未來開角型青光眼的治療提供了新的視角。其中，誘導性多能幹細胞（iPSCs）作為新型幹細胞類型，根據其自體來源的特性，成為潛在的臨床應用細胞類型。目前，利用iPSCs治療開角型青光眼仍然是極具挑戰性的任務。本文從iPSCs的特性揭示此類幹細胞臨床應用的困難及解決策略，並根據目前iPSCs在原發性青光眼治療方面的相關研究，概括其在不同物種、不同原因、不同病理進程的開角型青光眼模型中的治療效果。此外，iPSCs針對小梁網退行性病變的治療，存在其特有的問題，本文從安全性、治療時效性、特異靶向性方面進行闡述，並針對不同問題，結合目前研究熱點，提出針對性的解決策略，指明下一步研究方向。藉此文提供前沿的科學熱點問題，及時對國內外的研究進展進行總結，期望在科研工作者們的共同努力下，推動iPSCs在臨床方面的應用研究，最終為青光眼患者帶來光明。

【關鍵詞】 原發性開角型青光眼；誘導性多能幹細胞；小梁網重塑；眼壓

青光眼是由視網膜神經節細胞，視盤以及視神經的凋亡導致視覺損失的一類眼科疾病，是僅次於白內障的第二位的致盲眼病[1]。綜合中國流行病學的報道，2010年中國開角型青光眼和閉角型青光眼患者的分別為450萬和390萬。中國的快速老齡化以及後天性近視發生率的不斷提高或將導致原發性開角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）的發病率不斷提高。預計到2020年，開角型青光眼和閉角型青光眼患者將分別達到590萬和530萬[2-3]，屆時會給中國社會及患者家庭帶來巨大的經濟及精神負擔。

目前認為導致青光眼的主要原因包括高眼壓、種族、年齡和遺傳學因素等，其中，高眼壓是青光眼最為重要的致病原因[4]。眼壓產生於眼前節的房水循環。房水最初分泌於睫狀體，通過位於虹膜與晶狀體之間的狹小縫隙進入眼前節的房水循環中，隨後通過房水外排途徑排出眼。生理條件下，房水的產生與外排處於平衡狀態，從而維持正常的眼壓。原發性開角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）患者的房水外排途徑異常，從而導致高眼壓的產生[4-5]。房水外排的阻力主要來自於小梁網外排途徑，該組織是定位於角膜基部、毗鄰睫狀體的篩板狀組織，其正常功能的維持對房水循環的平衡以及眼壓的維持具有至關重要的作用[6]。然而，伴隨著整個生命過程，位於小梁網的細胞會不斷地凋亡[7]。正常生理狀況下，此現象普遍存在。在病理情況下，此類細胞的凋亡更為嚴重。隨著幹細胞技術的不斷成熟，利用幹細胞對已退行的小梁網組織進行重塑成為最有前景的生物治療手段。目前，應用於小梁網退行性病變的幹細胞主要包括小梁網成體細胞、間充質幹細胞和誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[8-10]。由於成體小梁網細胞和間充質幹細胞的臨床取材較為困難且為創傷性手術，iPSCs成為具有應用前景的幹細胞類型。本文將從iPSCs的特性、治療效果、臨床應用面臨的困難及相應對策等方面進行闡述，分析幹細胞治療小梁網退行性病變的本質，並對其應用前景進行探討。

1 iPSCs概述

iPSCs是利用胚胎幹細胞中高表達的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4個轉錄因子，將成纖維細胞重編碼為具有多能性的一類幹細胞[11]。此類幹細胞具有以下幾方面的優勢。這類幹細胞的多能性與胚胎幹細胞極為相似，可分化為多種細胞類型，包括神經細胞、肌肉細胞、心肌細胞及小梁網細胞等[12-13]，因此具備對多種疾病進行治療的可能性；與胚胎幹細胞相比，此類幹細胞不會對胚胎產生危害，因此不涉及倫理問題；iPSCs是自體來源的幹細胞，與異體來源細胞相比，可有效避免移植後嚴重的免疫排斥反應[11]。基於上述多種iPSCs的優點，為多種疾病的治療帶來了曙光。

此技術為治療人類疾病帶來希望的同時，也在臨床應用的過程中遇到了多種困難。（1）首當其衝的問題為染色體的穩定性。由此缺陷引發的iPSCs潛在致腫瘤性，是目前備受關注的問題。然而最近科學研究表明拷貝數的變異以及染色體的穩定性是重編碼前體細胞固有的現象，在重編碼的過程中得以體現[14]。與此同時，研究證明供體細胞類型及培養條件是影響染色體穩定性的關鍵因素[15]。（2）使用不插入基因組的重編碼方法是未來的發展方向，可有效避免遺傳突變及致腫瘤的潛在風險[16]。（3）儘管iPSCs作為自體來源的幹細胞，理論上不存在自體移植後的免疫排斥，然而，近年來科學研究證實表觀遺傳學的異常影響此類幹細胞的分化能力以及自體移植後的免疫耐受性，其主要原因為細胞分化的程度及細胞類型[17]。如來源於iPSCs的小梁網細胞以及視網膜色素上皮細胞並沒有引起免疫排斥反應，而心肌細胞及平滑肌細胞的移植則產生了相應的免疫排斥反應[10, 18-19]，也提示我們iPSCs在治療眼科相關疾病方面具有獨特的優勢。

綜上所述，iPSCs是治療眼科相關退行性病變非常有前景的幹細胞類型，同時也對我們提出了更高的要求，需要我們全力以赴優化其優勢，克服其缺陷，為青光眼患者提供臨床應用級別的iPSCs類型。

2 iPSCs與小梁網重塑

應用iPSCs，患者最為關心的問題即為其治療效果。目前，針對此問題，已有了初步的答案。其研究模型為青光眼小鼠模型及人眼體外灌注模型，其作用效果的相關指標為眼壓、房水流暢係數、視網膜神經節細胞數目以及小梁網組織結構等。此部分將綜合國內外目前相關研究進展，詳細闡述iPSCs對POAG的治療效果。

2.1針對不同物種POAG模型的治療效果

目前iPSCs治療不同物種POAG的研究已有相關報道。首先，不同物種的iPSCs分化為小梁網類似細胞的過程在物種間存在差異。我們團隊研究證實，小鼠或人iPSCs均可在人小梁網細胞系NTM5及人原代小梁網細胞PTM的條件培養基誘導下，定向分化為小鼠或人小梁網類似細胞。並根據小梁網細胞相關特徵對誘導分化的細胞進行鑒定[20]。小鼠iPSCs在短時間內（數周）即可分化為小鼠小梁網類似細胞，而人的iPSCs分化過程相對漫長（數月）[21]，分化的細胞方可展現與小梁網細胞相類的轉錄水平。此外，Abu-Hassan等[22]利用小梁網細胞的條件培養基對人iPSCs進行誘導分化1個月，展現出與小梁網細胞相類似的特性。上述報道提示我們不同物種的iPSCs 需不同的誘導分化時間得到所需的目的細胞。其次，不同物種iPSCs治療POAG的有效性被不同科研團隊證實。目前，小鼠iPSCs的治療工作主要針對不同的小鼠POAG模型開展。鑒於倫理問題，人的相關研究則集中在人眼體外灌注模型的使用，通過saponin致使小梁網細胞凋亡而誘發的青光眼模型。我們團隊研究證明源自小鼠iPSCs的小梁網類似細胞可有效降低眼壓、提高房水流暢係數、保護視網膜神經節細胞，且此移植工作對小梁網的結構並無明顯影響[10]。同時，Kelley等[22]研究發現，源自人iPSCs的小梁網類似細胞可有效提高人青光眼灌注模型的房水流暢率，而其他細胞類型並不具備此功能。以上數據證明源自iPSCs的小梁網類似細胞在不同物種的青光眼模型中發揮著相似的重要功能，對治療青光眼提供了嶄新的思路。

在探索iPSCs治療機制的過程中，有一重要發現引發了目前此領域科學家們的討論。我們團隊發現源自iPSCs的小梁網細胞可有效促進原代小梁網細胞或內源性小梁網細胞的增生[10]，說明「年輕」的小梁網細胞可使「年老」的小梁網細胞重新具備再次分裂的能力。此重要現象更新了人們對成體小梁網細胞的認識。一直以來，人們認為隨著小梁網組織發育並趨於成熟，小梁網細胞逐漸喪失了分裂能力，並在病理狀態下，出現嚴重凋亡，從而引發房水外排的不暢[7]。直至發現小梁成形術或生長因子可再次刺激小梁網細胞的增生，人們才意識到成人體內的小梁網細胞具備增生能力，可在某些因素的刺激下被捕獲出來[23-24]。根據目前報道，潛在的增生能力在不同物種的小梁網細胞內均有存在。上述實驗證據提示我們利用關鍵因子刺激成體小梁網細胞再次增生或將成為下一步治療POAG的有效手段。

2.2 針對不同原因導致POAG的治療效果

目前，iPSCs治療POAG的模型包括Saponin處理的人眼灌注模型、MyocilinY437H轉基因小鼠模型以及sGCalpha1敲除鼠模型。儘管Saponin模擬青光眼模型發病時間快且效果明顯，但其發病過程並不符合病理條件下的細胞動力學變化，提示我們此模型需謹慎使用[25]。相較於Saponin模型，遺傳突變POAG小鼠模型與POAG患者的發病機制極為類似。MyocilinY437H轉基因小鼠通過轉入人的Tyr437His Myocilin突變蛋白，使此蛋白無法在內質網中正常摺疊而導致內質網脅迫，從而造成小梁網細胞的凋亡，最終導致眼壓升高[26-27]。sGCalpha1敲除鼠則敲除一氧化氮信號通路中重要的酶類蛋白亞基，從而使小梁網喪失對一氧化氮的響應，而導致高眼壓的形成[28]。我們團隊利用源自iPSCs小梁網類似細胞對上述2種小鼠進行治療，結果發現此治療方案均可降低上述2種POAG小鼠的高眼壓，使眼壓在長時間內維持在正常水平[29]。上述報道提示此類幹細胞治療方案具有廣譜性，針對不同原因導致的POAG均有明顯的治療效果，也提示我們此類治療方案是符合目前中國國情的治療方案。

2.3對不同病理階段POAG的治療效果

來源於iPSCs的小梁網類似細胞對疾病早期的MyocilinY437H轉基因小鼠[10]、疾病中期的MyocilinY437H轉基因小鼠[30]以及疾病晚期的sGCalpha1敲除鼠3種不同病理學進程的青光眼小鼠進行了治療。在疾病早期，幹細胞移植治療可在短時間內對高眼壓進行有效調節，保護視網膜神經節細胞；疾病中期或晚期，幹細胞的治療需要相對較長的時間對眼壓進行調控，對此階段POAG小鼠視網膜神經節細胞的保護作用，目前尚不明確[10,28,30]。上述研究提示我們針對不同病理學進程的POAG患者，幹細胞治療效果可能存在差異，暗示我們及時發現青光眼癥狀並儘早治療是幹細胞有效治療的必要前提。

3 iPSCs尚存的問題及解決策略

iPSCs針對退行性的小梁網病變治療效果明顯，然而從實驗階段到臨床應用，尚有一段距離。期間需要我們對iPSCs的安全性、時效性以及特異靶向等問題進行全面的研究分析，提高iPSCs安全性，延遲其有效期並降低其不良反應。上述問題極具挑戰性，本部分將進行分別闡述上述問題及相應對策，促進iPSCs的臨床應用。

3.1 安全性分析及策略

為了提供臨床應用級別的小梁網類似細胞，最大程度的減少安全隱患，對iPSCs有以下幾點要求：（1）使用不插入染色體的重編碼方法獲取iPSCs，例如仙台病毒及mod RNA等[16]；（2）使用層粘連蛋白代替細胞飼養層，避免異種細胞的污染[29]；（3）使用血清替代物[29]；（4）移植細胞的高純度，避免iPSCs的殘留而導致畸胎瘤[10]。小梁網細胞作為重塑的對象，針對上述第4點要求需要我們特別注意。由於小梁網細胞缺乏特異表達的蛋白，為了得到100%的小梁網類似細胞，目前利用iPSCs特異性蛋白的免疫反應，經過多輪陰性篩選，儘可能地排除分化細胞群體中的iPSCs。經此方法純化後，小梁網細胞的純度可達到100%，而此篩選手段不可避免地造成了大量目的細胞損失，且需要我們謹慎測定純化後細胞的純度。為了降低此篩選方法帶來的安全隱患，尋找小梁網細胞的特異表達蛋白並應用其對分化細胞群體進行陽性篩選，成為下一步的研究方向，屆時此純化手段可有效提高純化率且降低損失率，降低iPSCs殘存率，提高其應用的安全性。

3.2 時效分析及策略

儘管目前的研究證明，源自iPSCs的小梁網細胞針對不同病理進程的小鼠存在不同的治療效果，經過一定時間後，POAG小鼠的高眼壓最終可得到有效降低並維持在正常水平。然而小梁網的重塑主要因為內源性小梁網細胞增生，因此重塑後的小梁網仍為「問題」小梁網，可能在一定時間後小梁網細胞再次出現凋亡並影響小梁網的排水功能。針對此問題，我們需要根據造成小梁網細胞凋亡原因進行精準分析，並利用CRISPR-cas9技術對遺傳突變基因進行糾正[31]，或使用相關因子促進移植細胞在體內的存活率，或進行多次治療，最終提高重塑組織的有效性，長期對POAG患者的房水外排發揮有效功能。

3.3 特異性靶向治療及策略

儘管iPSCs針對退行小梁網的治療效果明顯，但我們也希望iPSCs不會對其他組織產生影響。因此特異性的靶向成為本研究的另一目標。根據目前報道，體外培養的成體小梁網幹細胞靶向小梁網組織具有很好的特異性，而來自於iPSCs的小梁網類似細胞僅具有一定針對小梁網組織的靶向性，同時，移植細胞在眼前節的其他組織中（角膜及虹膜）也有檢出。近年來，隨著3D列印技術的不斷成熟，3D產品不斷地被應用於臨床。3D生物列印是在數字三維模型程序的驅動下，按照生理狀態下組織的組成成分，將其生物材料及細胞單元組裝在一起，打造出具有生物功能的模擬組織[32]。在iPSCs治療青光眼過程中，在逐步理解小梁網組織3D圖譜的基礎上，可利用目前相對成熟的3D列印技術，與iPSCs生物治療技術相結合，特異性地針對小梁網組織進行治療，有效解決特異性靶向的難題[33]。應用此策略前需解決以下幾個問題，包括源自iPSCs的小梁網類似細胞附著於細胞外基質組織的比例、此類細胞被列印後的存活率、正常或病理狀態下此人工模擬組織的功能、適合的手術移植方式、以及移植後此組織對眼前節其他組織的影響。二者結合的聯合治療手段是非常有前景的治療方案，然而目前未知問題對我們提出了更大的挑戰，需要更大的努力理解上述問題後，付諸實踐。

4 展望

綜合目前研究進展，iPSCs治療成為未來治療POAG的重要方向。此治療方式可成功解決目前多個難題，對已退行的小梁網組織進行重塑，並調節功能異常的小梁網，使其重新具備高效的房水外排能力。此次過程中，很多重要的實驗數據也更新了人們對小梁網細胞的認識，如成體小梁網細胞在某些刺激下可再次增生，完成房水外排所需的使命。此外，iPSCs治療是符合目前中國國情的一種生物治療手段，可針對退行性的小梁網病變進行廣譜性的治療。未來10年，伴隨著中國經濟的快速發展，此治療方案或將過渡為精準治療的有效手段，根據患者病情進行個體化治療。

參考文獻：略

來源：選自醫學空間戰略合作夥伴《中華實驗眼科》雜誌, 2017, 35(9):773-777，轉載請標明出處！

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