實用技術貼：教你做斑馬魚的納米藥物功能和毒性評價實驗

納米技術的最終目的是使人類能夠按照自己的意志操縱單個原子，在0.1-100nm空間尺度內製造具有特定功能的產品，實現生產方式的飛躍。納米技術在臨床中的應用是我們關注的焦點之一。然而，雖然納米藥物的研發如火如荼，但能真正上市的品種為數不多，而且幾乎都集中在癌症治療領域。造成這種情況的原因之一就是納米技術可能會造成不確定的生物學後果。

這篇文章將著重突出斑馬魚模型的特點和用途，希望此文能夠對不熟悉斑馬魚的研究人員起到一定的指引作用。本文將從斑馬魚特性開始、針對一些特別的模型展開篩選、藥效評價和安全性評價的實驗介紹，希望能在納米級交付系統開發中與複雜的臨床前篩查進行輕鬆地整合。

首先，我們將通過一些直觀地圖片來介紹一下斑馬魚的優勢。

斑馬魚轉基因模型地應用

就像上圖看到得那樣，斑馬魚這個模式生物擁有很多轉基因模型，而這些轉基因模型主要被應用在這些領域：1. 血管生成和抗癌藥物篩選；2. 器官熒光和器官特異性藥物。因為斑馬魚身體的透明性，我們可以很清楚地觀察到血管和納米藥物輸送系統的分布和功能，因此在腫瘤領域尤其是血管新生領域應用廣泛，尤其是你覺得染色太麻煩的時候。

環特生物部分轉基因魚（包括且不限於血管熒光（綠色）、（紅色）；中性粒細胞熒光；運動神經熒光；顱神經熒光；巨噬細胞熒光；軟骨熒光（綠色）；心臟熒光斑馬魚（綠色））

而具有熒光器官的斑馬魚的轉基因模型可用於跟蹤標記的納米級藥物遞送系統或用於測試其器官功效。例如，Tg（BMP4：EGFP）是具有綠色熒光心肌的模型，已被用於普通心臟和心臟毒性藥物（腎上腺素，多沙唑嗪，艾司洛爾和多柔比星）的功能篩選。

使用更先進的成像工具，還可以使用跳動斑馬魚心臟的假動力學3D圖像來分析藥物遞送後心臟功能的變化。同樣，可以使用斑馬魚的各種器官模型，例如具有熒光肝、腦、胰腺的器官模型來監測對不同納米材料的器官特異性反應。

在癌症領域的獨特價值

常規有以下幾種製作斑馬魚腫瘤模型的方法，如化學處理、轉基因技術和異種移植等。暴露於二甲基苯並蒽可誘導腸癌，Myc基因的過表達會導致斑馬魚中的T細胞白血病，與其他兩種方法相比，異種移植可以產生更多種類型的癌症（見下表）。

其中，用Qtracker紅標記的人B16-F10黑素瘤細胞的移植已被用於模擬斑馬魚胚胎中的人黑素瘤。注射納米級藥物遞送系統後，可以監測具有熒游標記物的異種移植物。研究人員可以通過計數循環腫瘤細胞的數量，在異種移植的斑馬魚模型中成像中了解到轉移。使用flk1：mCherry觀察移植的GFP標記的BRAF V600E異種移植物及其周圍血管形成的生長等。此外，腫瘤異質性可以通過分化狀態的不同通過不同熒游標記物標記來區分腫瘤細胞。

用斑馬魚模型進行納米藥物遞送系統的毒性篩選

任何新的藥物輸送系統如果不安全，那麼都是沒有用的。因此，許多成功獲得資助的納米藥物遞送系統的開發過程中，通常包括用小鼠模型進行的毒性篩選。然而，小鼠模型的臨床前研究可能非常耗時，而且對於大多數研究實驗室來說也是昂貴的。通過斑馬魚模型進行毒性篩選，我們可以促進更安全的生物安全的納米藥物輸送系統的誕生。

斑馬魚是研究毒性篩選的理想模型，因為斑馬魚胚胎可以模仿複雜的體內相互作用，而且與人類基因組和生物系統具有高度的同源性。斑馬魚胚胎還可以在暴露於納米材料時，對錶型和基因型異常進行監測，觀察發育過程中器官大小和形狀的變化是生物毒性判斷簡單而有價值的指標。而斑馬魚技術低成本、發育快速和易於處理的特性，可快速高產量和具有成本效益的臨床前篩查。

斑馬魚胚胎的死亡率和孵化率是生物毒性最常見且最方便的監測指標，兩個指標一般都在72 hpf時測量。較輕的毒性作用通常通過心臟缺陷來反映，也可以通過監測心率來評估。當心臟完全發育時，建議在48、72和96 hpf時計數心跳30秒，另外還可以在96 hpf後以24 h為間隔監測肝臟納米材料的積累部位。

結語

納米材料的功能和毒理學篩選對於成功開發納米藥物遞送系統至關重要，特別是當納米醫藥的安全性不斷受到質疑時。然而，許多相關研究沒有包括臨床前的動物模型研究，因為它們通常花費相當的勞動力、金錢和時間。

斑馬魚是一種有很大應用價值的替代動物模型，錯誤地被認為與人類的同源性差。然而，如上所述，斑馬魚與人類分享大多數疾病基因和生物系統。此外，斑馬魚模型的優點使其成為納米醫學研究的多功能動物模型。

最後，斑馬魚研究的實驗條件在不同的實驗間變化較大，使得不同實驗室間的比較和基準測試幾乎不可能實現。因此，我們也希望為那些想在研究中採用斑馬魚模型的人提供了一個指導方針，進而在將來可以建立一個斑馬魚基準，以加速納米藥物輸送系統的臨床應用。

【杭州環特生物】中國首家斑馬魚生物技術服務公司（CRO），面向醫藥、化工、食品、環境等領域，提供藥物研發、安全性評價、毒理學研究和生物醫學研究等專業服務。

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