性狀定位之重測序GWAS

近日，《美國人類遺傳學雜誌》（The American Journal of Human Genetics，AJHG）以「10 Years of GWAS Discovery: Biology, Function, and Translation」為題回顧了近10年全基因組關聯分析（GWAS）的成果，並對GWAS下個十年的發展及應用方向進行了展望。文章預測：在未來的10年，GWAS研究將會被大規模用於基於陣列的數據，尤其隨著大型全測序panel的出現，進行全基因組測序數據的樣本將多達數以百萬計。文章指出，GWAS的結果已經揭示了數百個複雜的疾病性狀，大多數關於性狀和疾病的研究中，基因組中的突變目標會顯得很大，因此，未來的GWAS將以全基因組測序為基礎。

GWAS研究方法包括基因晶元、簡化基因組測序、基因組重測序。基因晶元是根據已有的SNP信息定製晶元，不能發現新的SNP位點。簡化基因組測序覆蓋度只佔基因組5%左右，會遺漏很多SNP位點。基因組重測序可以在全基因組範圍內發現SNP位點且不會導致SNP位點的遺漏。相比於晶元GWAS和簡化GWAS，重測序GWAS具有以下顯著的優勢：

1）變異信息更全面。重測序是基於整個基因組進行變異位點的掃描和檢測，而簡化測序雖然可以均勻覆蓋基因組，但是整體覆蓋度不到基因組的5%，會有大量變異信息的丟失，為了獲得更豐富的變異信息，應該選擇重測序GWAS。

2）定位結果更準確。10X深度的重測序，SNP位點的準確性可以得到保證，20X以上的重測序還可以進行SV的分析，通過SV與性狀關聯，輔助SNP關聯結果，使定位效果更加準確。

3）分析內容更豐富。重測序數據可以對群體的LD衰減進行更準確的判斷，可以獲得準確的單體型信息，有助於後續驗證。

4）文章影響因子更高。重測序GWAS的文章影響因子大多在10分以上，簡化GWAS和晶元GWAS的文章一般是5分左右，為了提高文章水平應該選擇重測序GWAS。

鑒於重測序GWAS優勢如此顯著，小編特意為大家整理了重測序GWAS的研究方案。

重測序GWAS研究思路：

重測序GWAS研究策略：

材料選取原則：動植物自然群體，樣本具有代表性，且不能有明顯的亞群分化（例如生殖隔離等），質量性狀盡量為0、1二值性狀，數量性狀盡量精確量化記錄，並使表型總體呈近似正態分布，推薦樣本量200個以上。

測序原則：全基因組重測序，Illumina HiSeq，PE150，建議每個樣本測序深度>5×，具體測序深度參照下表。

模型選擇：GLM、MLM、EMMAX、Fast-LMM、Farm CPU等。具體模型根據群體結構做相應調整。

案列分析

Yano K, Yamamoto E, Aya K, et al. Genome-wide association study using whole-genome sequencing rapidly identifies new genes influencing agronomic traits in rice. Nature Genetics,2016.

材料：176個日本粳稻品種。

測序策略：Illumina HiSeq，PE100，5.8X，MLM模型。

結果解析：

1、共獲得383.8Gb的數據，平均測序深度5.8X，基因組覆蓋度達91.2%，獲得426,337 SNPs和67,544 indels，其中，43,323S個SNPs為非同義突變，1,678個indels為移碼突變，1,656個indels為非移碼突變。

2、從圖1a-d的表型數據分析可以看出，4種表型數據（抽穗期、植株高度、圓錐花序的長度、葉寬）均呈正態分布，多樣性豐富，圖1e的PCA分析顯示176個日本粳稻品種沒有明顯的群體結構。

圖1 日本水稻的表型多樣性和遺傳結構

3、文章通過混合線性模型進行GWAS關聯分析，鑒定到了與抽穗期相關的26個位點(?log10 P ≥4.77），我們關注的5個區域分別位於染色體1、3、6、7、11（圖2a），其中，位於染色體3和7的峰點與已報道的抽穗期相關基因Hd6和Hd2的QTL定位結果一致。位於1號染色體的候選區域被錨定在36.30Mb到36.65Mb之間（346Kb）（圖2b），包括91個與抽穗期關聯的位點，這些位點分布於7個基因上，其中基因LOC_Os01g62780（圖2c）與擬南芥的HESO1基因同源，該基因在擬南芥中表現為延遲開花，分析發現主要是328位的纈氨酸突變為異亮氨酸形成了兩種單倍型，含有單倍型B的品種抽穗時間遲於單倍型A的品種（圖2d）。分別將單倍型A和單倍型B的基因序列導入日本晴，導入單倍型B序列的日本晴開花時間遲於導入單倍型A序列的日本晴和對照組，說明水稻中的新基因LOC_Os01g62780與延遲開花相關。

圖2 GWAS分析1號染色體上與抽穗期關聯的基因

4、同理，作者對水稻的株高、穗長、穗數、葉寬、分櫱數等性狀也進行了全基因組關聯分析，獲得了與株高及穗長相關的鋅指轉錄因子GATA，首次發現了NAL1基因導致水稻穗數的減少，除此之外，還獲得了許多控制上述農藝性狀的候選基因。

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