下一代蛋白葯研發里程碑！全新分泌蛋白庫誕生記——專訪北大藥學院劉濤博士

葯明康德/報道

自從上世紀80年代初重組人胰島素上市之後，蛋白葯已成為現代生物製藥領域最重要的產品之一。之後的十餘年成為蛋白葯新品上市的黃金期，活性高、特異性強、毒性低的原研蛋白葯不斷湧現，21世紀蛋白葯全球年度銷售額已突破600億美元。

但受限於蛋白篩選方法的技術瓶頸，本世紀以來問世的重磅蛋白新葯開始減少，同時隨著抗體開發技術的成熟，新靶點蛋白的發現已成為抗體藥物研發的關鍵。今年6月北大天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室劉濤研究員團隊與博後導師、Scripps研究所Peter G. Schultz博士團隊合作，聯合建立了包含近千種藥用蛋白的分泌蛋白庫，並基於該文庫創建了逆轉錄病毒介導的高通量單細胞篩選方法，即旨在助力產業界開發更多治療性蛋白以及抗體葯的靶點。

劉濤博士與博士後導師Peter Schultz博士合影

劉濤博士基於在Scripps研究所進行的博士後訓練，其成果集中在蛋白藥物的篩選和改造，包括人源化牛抗體的開發、單細胞蛋白藥物篩選平台的建立、以及蛋白和抗體藥物的定點修飾（利用基因密碼子擴展技術）等領域，希望通過最尖端的科技助推蛋白藥物藥理性質和生產工藝的升級換代。

逆轉錄病毒華麗轉身 承載高效分泌蛋白篩選平台

葯明康德：您和Peter Schultz教授團隊合作建立的分泌蛋白庫研究成果，近期在《細胞》子刊《Cell Chemical Biology》雜誌發表。請您介紹一下該蛋白庫的研究契機，以及分泌蛋白對新葯開發最有代表性的助推方向。

劉濤博士：核糖體合成蛋白質之後，會被運送到細胞內不同的細胞器發揮作用。胞內蛋白直接進入細胞器，並駐留在細胞內發揮作用。而另一類蛋白質則通過內質網膜進入內質網腔進行加工，之後又被轉運到高爾基體內進一步加工，最終會被運送到細胞外發揮作用，這類蛋白叫做分泌蛋白。人類基因組中超過2000個基因編碼分泌蛋白，約佔整個基因組的10%，其中富含調控生命活動、具有重大藥用價值的蛋白，包括激素、細胞因子、生長因子、趨化因子和蛋白酶等。

全新分泌蛋白文庫（圖片來源：《Cell Chemical Biology》雜誌）

然而遺憾的是，目前大多數分泌蛋白的功能尚不清楚。有的蛋白在身體中發揮重要的正面作用，例如細胞分化、免疫調控等等；而有的異常蛋白則可能是刺激癌細胞異常再生的關鍵因素。如何尋找這些蛋白，是蛋白質藥物開發的一個關鍵問題。例如，哪些蛋白異常表達會刺激腫瘤發育和遷移，哪些蛋白會調控造血幹細胞的分化等等，我的團隊目前正在關注這些研究方向。

過去針對分泌蛋白的篩選方法效率不高，嚴重製約了科學家們對全新藥用蛋白和藥物靶點蛋白的發現。目前各大藥廠的蛋白質藥物篩選辦法基於96孔板或者384孔板，將蛋白一個一個放在多孔板里進行篩選，這樣的篩選方式不僅耗費大量成本和時間，更重要的無法實現蛋白質組合的功能篩選和測定。其實在機體內，產生特異性功能的往往不是單一蛋白，而是兩個甚至更多蛋白（或者蛋白亞基）的組合效應，如果使用多孔板來篩選數千個蛋白，根本無法做到組合效應的篩選。而在學術界，則由於成本的局限，幾乎沒有有效可行的辦法來針對分泌蛋白的功能進行篩選。所以蛋白藥物研發領域急需一種簡便易行的高通量篩選模式，正是基於這些迫切的需求，所以我們打造了一種全新的分泌蛋白文庫和單細胞篩選模式。

全新分泌蛋白文庫（圖片來源：《Cell Chemical Biology》雜誌）

葯明康德：請您介紹一下這個全新分泌蛋白庫的呈現方式及其高通量篩選模式。

劉濤博士：我們首先用逆轉錄病毒科下的慢病毒(Lentivirus)來包裝人類基因庫。與其它逆轉錄病毒相比，慢病毒可以感染非分裂期細胞，容納外源性基因片段大，其介導的轉基因表達能持續數月，且不會產生可觀察的病理學現象。由於該病毒包裝的特性，我們可以輕易實現每一個病毒包含一個特定分泌蛋白的基因；之後再促使病毒感染靶細胞，並且使感染比例得到調控，最終實現一個病毒感染一個細胞。逆轉錄病毒的增殖模式，就是將自己的基因片段整合到宿主細胞的基因組之內，如果能夠轉錄成功，則這個細胞就會增加一個特定的分泌蛋白的基因。通常我們會使這個蛋白基因帶有較強的啟動子，所以保證該特定蛋白的表達量較高。此外通過基因水平的改造，我們通過添加膜定位區將分泌蛋白固定在細胞膜上，從而實現了一個細胞一個基因的單細胞自分泌篩選。

因為細胞的尺寸非常微小，所以一滴液體內就可以包含數千個細胞，一個小指頭大小的試管可以包含107個細胞，從而實現107種基因的篩選（確切的說是107蛋白質或者蛋白質組合的篩選）。以這種方式進行單一蛋白或者蛋白組合的高通量篩選，效率會大大提高。篩選出有功能的蛋白的幾率，在理論上也會遠遠大於多孔板的傳統篩選方法。此外這種基於逆轉錄病毒的高通量新型篩選系統，屬於細胞水平的自分泌篩選系統，避免了蛋白的表達純化，從而使成本降到微乎其微。

一方面我們希望基於分泌蛋白庫，發現更多治療性蛋白，豐富蛋白藥物的種類。另一方面，我們課題已經建立起了抗體篩選平台，而抗體新葯研發的關鍵就是靶點蛋白的開發，所以我們希望通過這個平台尋找新的抗體開發靶點，為中國新葯研發奠定技術基礎。

下一代抗體藥物研發方向（來源：劉濤課題組）

密碼子擴展技術：開拓氨基酸「智造」空間

葯明康德：密碼子擴展技術也是您近年來專註、並期待能運用於生物製藥的尖端科技。這一技術宛如模擬造物主之手，來修改生命基礎物質的產生與組合法則。請您介紹一下您這個方向的研究契機和最新進展。

劉濤博士：地球上絕大多數生物體內的蛋白質翻譯過程，由61個密碼子和3個終止密碼子執行，其中61個密碼子產生20種天然氨基酸並組成無數種不同的蛋白質。從自然進化的角度而言，多種密碼子對應同一種氨基酸的簡併性，以及3個密碼子作為蛋白質終止合成的信號，似乎是一種鹼基的浪費。我們猜想遠古時代天然蛋白質可能由四五十種甚至更多氨基酸組成，但很多種氨基酸因為耗費能量過多所以被進化所拋棄；但也有可能原來只有十幾種甚至只有個位數的氨基酸存在，但在進化的過程中逐漸增多。在實驗手段不斷豐富的今天，我們完全有能力利用儘可能多的氨基酸種類，豐富蛋白質的特點尤其是蛋白質的功能。

Peter Shultz導師課題組通過對蛋白的翻譯機器進行改造，開發了全新的密碼子擴展技術，將生物體內閑置的終止密碼子變身為有義密碼子，從而讓生物體合成出含有21種甚至是22種氨基酸的蛋白。將這種密碼子拓展技術應用到蛋白大分子製藥領域，不僅可以利用多種功能團提升現有抗體藥物的功能，實現生物藥物的升級換代，甚至有望產生含有20種氨基酸的天然蛋白所不能實現的全新功能蛋白。

密碼子擴展技術（來源：Annu Rev Biochem 2010, 79, 413.)

葯明康德：和傳統生物葯相比，含有非天然氨基酸的全新蛋白質有哪些具體的應用價值？相應的蛋白藥物又有哪些優勢？

劉濤博士：多一種特定的非天然氨基酸可以發揮許多種功能。它可以形成組分更為豐富的蛋白質，我們有可能定點改造蛋白質的翻譯機器，在重組蛋白、細胞內、甚至動物內產生超越20種氨基酸的蛋白質。

首先這種技術可以應用於蛋白質藥物的定點修飾。天然蛋白質是20種氨基酸的組合，但能夠進行化學交聯反應的氨基酸種類卻很少，常用的結合位點為賴氨酸。然而一般蛋白質會含有很多賴氨酸，例如抗體上存在40多個賴氨酸，如果我們想對抗體進行偶聯修飾的話，那麼偶聯修飾物可能會被隨機結合在這40個位點之中的任意一個。而如果我們將1個具有特殊反應活性的非天然氨基酸插入蛋白之中，則偶聯反應只會發生在這個特定氨基酸所在的位置，從而實現可控的精準修飾。這種特異性修飾可以應用於蛋白質偶聯藥物，比如抗癌的抗體藥物可以更好地靶向腫瘤細胞，將細胞毒素帶到目標腫瘤；同時也可以應用於各種分子探針，使定點偶聯的熒光基團更好地與大分子結合，形成穩定的觀測效果等等。

另外蛋白質藥物對於溫度的敏感常常導致其構象變化，提高蛋白質熱穩定性是蛋白質藥物研究中的一個重要方向，而非天然氨基酸可以介導蛋白結構上的遠距離共價交聯，有望提高蛋白質藥物的熱穩定性。此外，通過引入非天然氨基酸，還可以定點、系統地研究蛋白質翻譯後修飾（包括磷酸化、甲基化、乙醯化等等），這些修飾與細胞生命活動的調控和疾病的發生髮展息息相關。

George Church教授團隊改寫大腸桿菌密碼子數量（圖片來源：《科學》雜誌）

葯明康德：目前密碼子擴展技術主要聚焦於終止密碼子的重新利用，您覺得該技術在未來還有哪些發展前景？

劉濤博士：重新編輯密碼子除了激活終止密碼子，從合成生物學的角度而言還有無限的想像空間。哈佛醫學院George Church教授去年領銜完成了合成大腸桿菌基因組項目，只使用了57個密碼子，其他7個密碼子被空出來，有望實現多種不同非天然氨基酸的插入。天津大學元英進教授等的多篇《科學》論文中證明酵母基因組重新設計和全合成的可行性，標誌著合成生物學發展的新高潮。隨著合成生物學的發展，未來我們有望進化出含有多種非天然氨基酸的物種。此外，在生物醫療領域，北京大學周德敏教授利用終止密碼子擴展技術重新編程了病毒基因組，產生依賴非天然氨基酸生長的活病毒疫苗，為未來開發HIV疫苗等奠定了技術基礎。這些重編程的細菌、病毒、噬菌體等有望在生物醫療、生物能源、生物材料等等領域派上大用場。

所以從理論上來說除了3個終止密碼子，其他密碼子也有可能被節約後重新利用：同義密碼子的數量可能被減到最小，非核酸物質也可能行使終止密碼子的功能，也許有一天我們可以產生四五十種不同的氨基酸來參與蛋白質合成。當然如果要最終實現人工合成的蛋白質作為藥物應用到臨床，還需要穩定的合成方式來保證產量和質量。這些技術的實驗和運用，甚至有朝一日實現人類基因組的全合成，需要化學生物學、細胞生物學、合成生物學多學科的共同努力。

名家師承 投身下一代抗體研發之路

葯明康德：在您學習成長的過程中，有哪些師長對您的學術生涯有過重要的影響？

劉濤博士：在我的成長中最大的影響來自父母，他們都是大學教師。我父親是南開大學化學院院長劉育教授，他主要的研究方向是功能分子設計與合成、配位反應熱力學、納米超分子體系構築。父親的時光幾乎都在實驗室度過，每日早出晚歸，幾乎沒有雙休日和節假日，所以在學生中也有很高的人氣。正是因為父親的榜樣作用，才讓我從小就有成為優秀科學家的夢想。不過在專業領域方面，我選擇了生物製藥，我希望更近距離地關注人類健康。

劉濤博士與南開大學化學學院院長劉育教授合影

我非常感謝我的博士導師美國俄亥俄州立大學的Dehua Pei教授，是他帶我進入了學術的殿堂，給我指明了科研發展的方向。對於我而言另一個重要的人生導師就是Peter Schultz教授，他本人是美國科學院及美國醫學院院士，他也培養了很多美國科學院院士。此外北大藥學院院長、清華藥學院院長、北大化學生物學系主任也都是他的高徒。他更是9家科技及生物科技公司的創始人，率先將前沿分子多樣性技術應用於能源、材料科學以及人類健康等領域。

在Peter Schultz導師的帶領下，我在美國完成的最重要研究成果，就是在Scripps建立的人源化牛抗體工程技術。牛抗體是繼羊駝抗體（又名納米抗體）和鯊魚抗體之後的第三個骨架不同於人的抗體。通過對牛抗體進行改造並且人源化，我們開發了一些列潛在的抗體藥物，其中一款生長激素融合抗體，將生長激素在老鼠體內的半衰期提高了100倍，有望在人體內將生長激素一天一針的注射頻率降低到一個月一針。我們希望未來還能將之應用於更多的藥物類型，例如長效胰島素等來幫助治療2型糖尿病。

人源化牛抗體融合生殖激素（來源：劉濤課題組）

葯明康德：在學術之外，您還曾有過哪些興趣愛好？而除了以上您所談過的科研領域，您還有哪些重要的研究經歷？

劉濤博士：少年時代我的興趣非常廣泛，除了對科學具有濃厚的興趣之外，我還喜歡旅遊運動，在不少體育比賽中斬獲過好名次，我曾經還一度是電子競技的高手。我覺得與電子類相關的興趣以及其他業餘愛好，對於所有人而言都是智力開發的契機，但前提是要有自制力、能分清主次，不能讓與主業無關的愛好佔用太多時間和精力。人生的誘惑無處不在，酒不醉人人自醉，善加利用便是觸類旁通的靈感，過度沉迷則是得不償失的悔憾。如今有了自己的科研團隊，少年時代的愛好已經逐漸淡出了我的生活，目前我的精力幾乎全部放在科研上了，我覺得生命科學有太多的未解之謎，在這個知識大躍進的時代、科研轉化從量變到質變的時代，我們應該把握機遇迎接挑戰，完成時代賦予科學家的使命。

劉濤博士在美國滑雪場留影

我非常感謝北京大學藥學院給我提供了報效祖國的機會，這裡有著頂尖的科研平台，以及有張禮和院士、周德敏院長等一批傑出的前輩給我們指引方向。我現在所在的天然藥物及仿生藥物實驗室隸屬於北大醫學部，所以除了基礎科研之外，我還有機會與臨床醫生合作並肩投入大項目研究。基於納米分子影像探針的癌症微創介入診療導航技術是國家973重點項目，我作為影像探針方向的骨幹之一有幸參與研究，其中還有腫瘤專家、納米材料專家和顯微鏡製造專家。目前我的課題組與幾位腫瘤專家已經展開了合作，開發基於抗體和蛋白的腫瘤顯像以及治療等方面的工作。不論是基礎科研還是大型合作項目，我都希望更好地利用自己的知識和現有資源，與其他領域的專家合作解決大眾健康問題，親身感受從基礎科研到臨床的轉化，推進國計民生問題的解決。

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