實驗室抗體如何挑選

一般買來的抗體大約每100mg 200-500美元（當地價格），比黃金還貴（2016年1月的黃金價格為每克35.29美元）。而且有時這些「比黃金還貴的花銷」還會打水漂……

加州大學聖地亞哥分校的細胞生物學家Stephan Lange的論文手稿基本上都準備好了，這時他打算再檢查核對一下他的抗體：Lange對缺失G蛋白偶聯受體的小鼠樣品進行染色，按道理說抗體不會出現信號。然而結果卻是它顯色了，Lange只好把他論文中基於抗體的這部分刪去，而剩下的一部分卻不足以吸引人了。

這令Lange失望極了，不過值得安慰的是，他並不是唯一一個有此體驗的實驗人員，抗體可以說是生物學實驗室里最常用，也最容易出現問題的試劑，而且這種試劑還不便宜。Lange說，一般買來的抗體大約每100mg 200-500美元（當地價格），比黃金還貴（2016年1月的黃金價格為每克35.29美元）。而且有時這些「比黃金還貴的花銷」還會打水漂，來自Mol Cell Proteomics雜誌的一項研究指出，在被檢測的5000種商用抗體中， 只有一半能在Western blotting和免疫組化實驗中均有效，一些研究人員還認為問題抗體是許多科學研究無法重複的罪魁禍首。

為此越來越多的科學家希望能提出更高的抗體標準，全球生物標準研究所（Global Biological Standards Institute）由此制定了抗體驗證準則和試劑操作手冊。但單單是這些並不夠，研究所主席Leonard Freedman指出，這還需要多方合作，比如雜誌拒絕低標準驗證抗體發表論文，資助機構拒絕為可疑試劑提供資金等等。事實上，今年美國NIH將會要求基金申請人驗證他們使用的抗體，雖然目前還不影響評分。

一些製造和出售抗體的公司也在嘗試梳理其產品目錄，執行更嚴格的驗證檢測，提高其試劑的公信力。如antibodies-online公司就已經開始與獨立檢驗單位Science Exchange 展開合作，為已驗證的抗體提供一個特殊的「獨立驗證」徽章。

新的標準開發進程需要時間，目前這一市場是「賣方擔保」，但從長期來看，最終抗體有效性的責任還是會落在買方肩上，「科學家們需要能確保他們所使用的每個抗體都經過了驗證，」來自洛斯阿拉莫斯國家實驗室的分子生物學家Andrew Bradbury說。雖然目前還無法完全做到這一點，The Scientist收集的一些小Tips也許能幫助你發現實驗中最靈敏，特異性最強，以及實驗可重複的抗體。

了解你所使用的抗體類型

多克隆抗體是對某個抗原產生應答的B細胞分泌的所有免疫球蛋白。為了得到多克隆抗體，第一步是將靶標蛋白注射入動物，一般是兔子，然後收集動物血清，血清中包含有幾種結合在靶標蛋白上的抗體，這些抗體親和力不同，而且也會有一些與抗原無關的抗體。通常針對同一靶標的多個抗體能提升實驗中的信號。

如果需要更一致的抗體，那麼就要培養單個B細胞，將它們與永生細胞融合形成、雜交瘤細胞系，產生靶向特殊位點的單克隆抗體。從而找到生成目標抗體的培養基，利用細胞系大批量生產單克隆抗體。

然而即使是在單克隆培養體系中，細胞也有可能停止生成抗體，或者抗體基因發生突變，因此Bradbury指出最好是走多一步——通過編碼序列的DNA來確定單克隆抗體，而不是通過細胞系來確定。對於那些所謂的重組抗體，目標抗體基因應該來自B細胞，並且通過測序，當然前提是序列已經被公布的。無論細胞系發生了什麼，採用了這一DNA或者序列的研究人員都可以得到確定的抗體，科學家們甚至可以調整序列，無需注射動物就能獲得新的抗體。

同時製造抗體的抗原也很重要，合成肽段也許能生成適用於Western blot的抗體（蛋白已經發生了變性），相反完整蛋白來源的抗體也許就無法檢測出變性了的蛋白。

做好實驗前工作

毋庸置疑，實驗前首先需要科學文獻，檢查一下其他研究人員追蹤你的興趣靶標時用的是什麼抗體。一些廠家和網站（譬如 antibodypedia.com 和 CiteAb.com ）都會列出抗體參考文件。

仔細的翻查這些論文，來自Cell Signaling Technology 公司抗體研發部科學家Anthony Couvillon建議道。看看這些論文是否發表在著名期刊上？作者是否展示了全部Western blots，從中是否能看到其它非特異性條帶？他們是否用來合適的對照？

不要以為發表論文中採用最多的抗體就最適合你，挪威奧斯陸大學的蛋白質組學研究專家 Fridtjof Lund-Johansen說。通常每個人使用的都是前人第一次用的那個抗體。

理智選擇抗體產品

目前抗體市場上的一大問題就是製造廠商並不一定就是銷售方，Proteintech公司創始人與總裁Jason Li說（這家公司只銷售自製的抗體）。抗體目錄上有這麼多的種類，很少有人會去確保每種產品都有效。

為了確保購買有效的抗體，我們需要仔細審查 賣方提供的資料。是否能提供令人信服的數據來確保抗體適合於你的實驗？如果需要的是一種修飾後蛋白的特殊抗體，比如乙醯化 後的蛋白，那麼製造商施法進行了肽段array，針對幾種不同的蛋白修飾進行驗證。

Couvillon建議檢查供應商提供 同一靶標的所有產品，如果分子量或者細胞位置在結合同一抗原的抗體之間存在差異，那麼就值得懷疑。你可以挑選一些抗體進行嘗試，不過值得注意的是，如果你在不同銷售商處發現了同樣的數據表，那麼也許就是打著不同招牌，在賣同樣的東西。

自我檢測

耶魯大學醫學院的病理學教授David Rimm表示，即使是從信任的廠家那裡購買得到的抗體，他也要先自己檢測一下。由於之前他曾在一項臨床癌症實驗中被抗體問題困擾，因此他設計出了一種詳細的運算方法來驗證抗體。(Biotechniques, 47:197-209, 2010).

他主要檢測的是靈敏度和信噪比，對於Western blot實驗來說，抗體應該能在靶標分子量處很好的顯示條帶，而不是其它；對於免疫組化來說，抗體則能識別蛋白殘基出現的組織，而不是其它。對於靶標蛋白表達量高的細胞或組織，抗體也應該能顯示出其相應的水平，如果你能接觸到不只一種抗體，那麼就找出最匹配的抗體來。

另外，實驗中抗體也應該會與負對照有少量結合，金標準是將抗體用在缺少靶標蛋白的細胞或組織上。2014年Proteintech 嘗試利用RNA干擾（RNAi）敲除細胞系中的基因，用以驗證他們的抗體。到去年秋天，這家公司已經檢測了將近800種抗體（其目錄上有12000中抗體）。英國的abcam 公司則採用的是CRISPR 基因編輯技術敲除細胞系來驗證抗體，他們計劃從2015年年底開始，每年檢測300-500種抗體，其公司也已經停售了部分檢測失敗的抗體。

再次檢測

如果找到了一種適合你實驗的抗體，那麼首先要確保它對於不同的科學家和不同的時間段都是可重複的，然後在每次訂購的時候都要進行再次檢測。前文所提到的Rimm教授就是因為不同批次的抗體引來了大麻煩：他研發了一種利用抗體的臨床檢測方法，但是當他幾年後訂購相同產品的時候，卻發現了不同的結果。

這也就是多克隆存在的主要問題：不同批次的放血，或不同的兔子都會產生不同的抗體混合物，這在某種程度上可以通過嚴格的動物對照來進行控制，比如使用同樣培養條件下，同一性別遺傳相近的兔子。

按理說，單克隆抗體應該是一種抗體，但這也不能保證多批次就能獲得相同的結果。其中部分的原因在於並不是所有的所謂單克隆培養都是來自單一抗體生成血細胞。一些其實是寡克隆（oligoclonal），源自多個抗體生成細胞，其產生的抗體會出現差異。

重組抗體能避免這些情況的發生，但它們也不是完美的，比如不同宿主細胞系也許會形成不同的翻譯後修飾，改變其親和力。甚至培養基中的pH或者氧水平都會影響最終的結果。此外，無論你訂購的是哪種類型的抗體，運輸途中出現的解凍，都有可能破壞蛋白。

與他人交流

如果你第一次嘗試失敗的話，不要放棄，打電話給供應商尋求技術支持，一些公司也許會提供新的抗體給你。或者再仔細翻查操作手冊，某些抗體也許需要特殊的方法。

如果你找到了一種好的抗體，並發表了論文，那麼詳細的提供廠家，產品和實驗詳情能幫助他人更好的複製你的發現。

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