女神又1篇Nature！找到「關鍵」，讓CRISPR達到前所未有的精準度

9月20日，發表在最新一期Nature雜誌上題為「Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy」的研究中，來自加州大學伯克利分校、麻省總醫院等機構的研究者們鑒定出了Cas9蛋白中的一個關鍵區域。通過調節這一區域，有望產生了一個超精準的、具有最低脫靶切割水平的基因編輯工具。CRISPR先驅Jennifer Doudna教授是這篇論文的通訊作者。

先前成果

5年前，Doudna教授與現任Max Planck研究所感染生物學部主任的Emmanuelle Charpentier教授在Science雜誌上發表了一篇題為「A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity」的重要成果，首次揭示了CRISPR/Cas9這一天然免疫系統的基因組編輯功能。此後，科學家們一直在追求降低這一技術的脫靶編輯（即，編輯了預想之外的基因）。因為，提高CRISPR/Cas9的準確度對基礎研究，以及基因編輯的臨床應用非常重要。

當前，利用CRISPR-Cas9技術的研究人員首先需要構建一個sgRNA（single-guide RNA）。sgRNA中包含一段與目標DNA匹配的序列，被附著在Cas9酶上。將Cas9-sgRNA複合物引入到目標細胞後，sgRNA會找到與其匹配的DNA序列，然後，Cas9酶結合目標DNA序列，切斷雙鏈。不過，正如前文所說，Cas9-sgRNA複合物也會導致不受歡迎的脫靶切割。

圖片來源：網路

在過去的兩年里，有研究小組設計出了「升級版的Cas9蛋白」，包括eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1。Doudna教授及其小組成員一直在探索為什麼「升級版的Cas9蛋白」能夠比已被廣泛應用的、來自釀膿鏈球菌的野生型Cas9蛋白實現更精確的切割。

圖片來源：Nature

最新發現

在最新發表的這項研究中，科學家們利用一種被稱為單分子FRET（(F?rster resonance energy transfer）的技術，來精準測量當Cas9-sgRNA複合物結合DNA後，這種複合物中不同的蛋白質域（protein domain），尤其是REC3、REC2 和HNH究竟是如何移動的。

The Cas9 protein (gray) is an RNA-guided nuclease that can be programmed to bind and cut any matching DNA sequence (dark blue double helix), making it a powerful tool for genome engineering. Upon target binding, Cas9 protein domains undergo conformational rearrangements (the motions of individual amino acids are represented by rocket tails) to activate the Cas9-sgRNA complex for target cleavage. The REC3 domain (teal) is responsible for target sensing, which signals the outward rotation of the REC2 domain (magenta) to open a path for the HNH nuclease domain (yellow). This active conformation of Cas9 is then capable of triggering concerted cleavage of both strands of the target DNA. (Janet Iwasa graphic)

首先，他們發現，Cas9突變體的HNH構象開關的閾值比野生型Cas9的相應值要高得多，這使得當結合到非目標序列時，eSpCas9(1.1) 和 SpCas9-HF1這兩種突變體更不容易激活它的「剪刀作用」。

接下來，研究者們發現，REC3域負責感知靶向結合（target binding）的準確性，然後向REC2域發出信號，讓其為HNH核酸酶域打開一條通路，最終激活Cas9的「剪刀作用」。

隨後，研究還證實，通過讓REC3發生部分突變能夠改變Cas9蛋白的特異性，使得除非sgRNA和目標DNA非常匹配，否則HNH核酸酶域不會被激活。在這一研究中，科學家們設計出了一種改良版的、超精確的（hyper-accurate）Cas9——HypaCas9。研究證實，HypaCas9保持了它的「中靶」（on-target）效率，且區分人類細胞中目標位點和脫靶位點的能力略有提高。

該研究的共同第一作者、Doudna 教授實驗室的研究生Janice Chen說：「我們發現，Cas9酶的REC3域（REC3 domain of Cas9）中微小的改變就會影響『中靶編輯』（on-target editing，正確編輯了目標DNA）和脫靶編輯之間的差異。」

Janice Chen（圖片來源：Doudna lab）

未來期望

研究人員認為，作為DNA切割的主要控制器，他們所鑒定出的這一蛋白質域無疑是用來進一步改善CRISPR準確性的一個非常明顯的「目標」。重新設計這一區域有望幫助科學家們「定製」Cas9的突變體，從而最小化CRISPR/Cas9編輯錯誤區域DNA的機會，克服阻礙這一技術用於疾病治療的「脫靶效應」。

通過繼續探索Cas9的結構、功能和動力學之間的關係，Doudna教授和她的團隊希望能進一步設計出一種具有精妙敏感性的Cas9蛋白，實現更加可靠、有效的基因編輯。

其它論文

作為CRISPR先驅，Doudna教授在CNS上發表論文可謂是「家常便飯」。今年7月發表在Science雜誌上題為「Structures of the CRISPR genome integration complex」的研究中，她的團隊揭秘了CRISPR蛋白Cas1-Cas2是如何找到它們的目標的。研究證實，Cas1-Cas2對插入位點的識別並不是依賴序列，而是依賴結構。

而剛剛過去的8月，「女神」團隊又在Cell雜誌上發表了一篇題為「A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9」的論文，找到了CRISPR-Cas9系統的一種廣譜抑製劑，也就是「關閉開關」。這項成果將為阻止不法的、失控的CRISPR應用提供了手段，幫助提高CRISPR技術的安全性。

參考資料：

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