重大發現：circRNA存在細胞特異性m6A修飾！

8月29日，Cell子刊Cell Reports在線發表了哈佛大學醫學院Cosmas C. Giallourakis和Alan C. Mullen為共同通訊作者的文章，介紹發現circRNA廣泛存在m6A修飾，且呈現細胞特異性的特徵[1]。

m6A是RNA最常見的共價修飾方式之一，之前在線性的mRNA和lncRNA中均有報道，circRNA中是否也有m6A修飾是一個非常值得探索的重要科學問題。就在今年3月10日Cell Research雜誌發表的中科院上海計算生物學研究所王澤峰教授為通訊作者的文章曾介紹發現circRNA中存在m6A修飾並可促進circRNA翻譯蛋白[2]。這也是首次報道circRNA中存在m6A修飾。

本文進一步證實了circRNA中存在m6A修飾，還發現了一些m6A修飾的circRNA 的特徵，包括：

（1） m6A修飾的circRNA所對應的線性RNA中同一位置很少被m6A修飾，mRNA更傾向於在其3』UTR區攜帶m6A修飾。

（2） m6A修飾的circRNA呈現高度的細胞特異性分布，相同的circRNA分子在不同的細胞中m6A修飾的狀態也不盡相同。

（3） m6A修飾的circRNA往往對應於較大的外顯子區域，且兩側傾向於存在轉座元件。

（4）circRNA與線性RNA有共同的修飾酶和識別酶。METTL3參與circRNA的m6A修飾， YTHDF1/YTHDF2參與識別。

（5） m6A修飾的circRNA所對應的mRNA相對更不穩定。

大家一定已經迫不及待的想要知道作者是如何發現circRNA的m6A修飾並找出這些特徵來的，下面我們就一起學習一下吧：

作者利用什麼技術探索circRNA 的m6A修飾的？

RNA中m6A修飾主要通過特異性的抗體進行研究，本文的技術方法也是如此。作者首先利用斑點雜交實驗證明了去除核糖體RNA後經過RNase R消化後的RNA樣品中存在m6A修飾。抗m6A抗體進行RIP實驗中未能與抗體結合的RNA組分（sup）雜交結果為陰性，而可以結合該抗體的RNA組分（eluate）雜交結果為陽性，證明了所使用的抗m6A抗體可以特異性識別m6A修飾，且不會引入假陰性結果，即所有攜帶m6A修飾的RNA可以全部被檢測到。

值得一提的是，tRNA往往不容易被RNase R消化，但已有的文獻報道表明tRNA很少攜帶m6A修飾。抗m6A抗體RIP中Eluate部分缺少75nt組分也間接證明了這一點。

圖1 斑點雜交實驗證明circRNA中存在m6A修飾 （來自[1]，排列有改動）

作者還專門設計了一套分析circRNA的流程體系，稱為AutoCirc。從文中描述的結果來看，AutoCirc體系運行速度更快，比CIRCexplorer快10倍，比MapSplice快250倍，且對計算的硬體要求不高。

作者在本文主要用該流程體系分別分析抗m6A抗體RIP實驗後獲得的RNA樣品和常規RNA樣品中的差異情況，通過分析所對應的基因組區域及不同來源樣品間的橫向比較得出了circRNA中m6A修飾特徵。

為證明抗m6A抗體RIP實驗的特異性，作者還進行了內標實驗，即在所分析的RNA樣品中加入確定攜帶或不攜帶m6A修飾的內標，看最終分析獲得數據中是否會存在假性的結果。結果表明該流程體系結合去除rRNA後抗m6A抗體RIP實驗能非常特異性的富集m6A修飾的內標，說明了該體系的特異性和有效性，可有效避免假陽性，假陰性的情形。

圖2 AutoCirc流程分析circRNA（來自[1]）

circRNA中m6A修飾有何特徵？

作者首先選擇了人胚胎幹細胞（hESCs）進行分析，利用該流程體系，分析了m6A修飾RNA與總RNA的情況，分別比較分析了其中circRNA和所對應的線性RNA的情況。

m6A修飾circRNA總體情況

作者在hESCs樣品中共分析到1404種m6A修飾circRNA，它們有41%可以從總circRNA分析的結果中找到（比例有點低，原因不明），但如果將ENCODE資料庫的non-polyA RNA數據整合之後，就有83%的可以在hESCs來源的circRNA庫中找到。

m6A修飾circRNA與總circRNA的基因來源大致一致，主要是mRNA的外顯子來源，也有一定比例的內含子來源。

圖3 hESCs中m6A修飾circRNA總體情況 （來自[1]，排列有改動）

m6A修飾circRNA對應於更大的單個外顯子

與總circRNA的特徵相類似，絕大部分m6A修飾circRNA也是外顯子來源的。作者首先分析了m6A修飾circRNA所對應的外顯子的情況，包括外顯子數目，大小特徵等。比較之後發現m6A修飾circRNA所對應的外顯子相對更大。所對應的外顯子數目來看，m6A修飾circRNA所對應的外顯子數目以1-2個為主，隨著外顯子數目增多而逐漸減少。因此m6A修飾circRNA傾向於對應於更大的單個外顯子。

圖4 m6A修飾circRNA對應外顯子特徵分析 （來自[1]）

circRNA與所對應的mRNA攜帶的m6A修飾位點分布不同

mRNA中m6A修飾傾向於集中在最後一個外顯子，對應於成熟mRNA的3』UTR區，而circRNA很少有來源於該區域的，那麼circRNA與所對應的mRNA攜帶的m6A修飾位點分布情況如何呢？

絕大部分m6A修飾的circRNA均可從總RNA中檢測到所對應的mRNA，但circRNA和對應的mRNA所攜帶的m6A修飾位點分布差別非常明顯。circRNA來源的m6A修飾位點傾向於對應上游和中間的外顯子區域，而mRNA來源的m6A修飾位點傾向於對應於末端3』UTR區。

圖5 circRNA與對應mRNA的m6A修飾位點分布不同 （來自[1]）

circRNA的m6A修飾呈現細胞特異性特徵

circRNA的m6A修飾在不同來源的樣品中是否一樣呢？為回答該問題，作者利用Hela細胞進行了比較。總體而言，m6A修飾的circRNA在兩種細胞中差別非常大，hESCs和Hela細胞遺傳背景和基因表達特徵有較大的差別，circRNA表達譜有差異也很正常。那麼排除細胞特異性的總circRNA表達譜差異的因素，同一mRNA來源的circRNA的m6A修飾狀態以及同一circRNA在不同細胞之間的m6A修飾狀態有無差別？

作者挑選了在hESCs和Hela中均有表達的mRNA基因進行分析，比較後發現這些基因所對應的m6A修飾circRNA有較大的差異，高達65%的來源於Hela的m6A修飾circRNA無法在hESCs中檢測到。說明即使mRNA都有表達，所對應的m6A修飾circRNA還是會有明顯的細胞特異性特徵。

反過來，相同的circRNA在不同細胞內m6A修飾的狀態怎樣？比較分析Hela和hESCs均有表達的circRNA分子，它們對應的m6A修飾狀態也有較大差別。Hela來源的m6A修飾circRNA有41%的不會在hESCs中被修飾。

值得一提的是，有些m6A修飾的circRNA所對應的mRNA並不能被檢測到，這也可以部分解釋上面的這兩個分析角度所得到的差異狀態有所區別。

圖6 細胞特異性m6A修飾circRNA表達特徵（來自[1]）

上面的實驗設計思路有點繞，可能不太好理解，而RT-PCR的實驗就可以非常清晰的展示m6A修飾的circRNA細胞特異性表達特徵。對於同一基因對應的circRNA在不同細胞中是否有表達會存在三種不同的情況：

（1）mRNA 在Hela和hESCs中均有表達，但circRNA只在Hela細胞中存在的： RASSF8 和KANK1的circRNA只在Hela中出現，並且可以被m6A修飾。

（2）mRNA 在Hela和hESCs中均有表達，但circRNA只在hESCs細胞中存在的： SEC11A和TMEFF1的circRNA只在hESCS中出現，並且可以被m6A修飾。

（3）mRNA 在Hela和hESCs中均有表達，並且circRNA也在Hela和hESCs中都存在的：

KIF20B 和 NUFIP2的circRNA在Hela和hESCs中均存在，也都可以被m6A修飾。

RAPGEF1 和ATP5C1 circRNA在Hela和hESCs中均存在，但RAPGEF1的circRNA只在Hela中被m6A修飾，ATP5C1的circRNA只在hESCs中被m6A修飾。

因此，造成細胞類型特異性的m6A修飾的circRNA譜的差異因素不僅是細胞特異性的circRNA表達差異導致的，也存在細胞特異性的circRNA m6A修飾狀態差異。

圖7 RT-PCR分析細胞特異性circRNA m6A修飾狀態 （來自[1]）

circRNA的m6A修飾程度有什麼特徵？

特定的RNA分子被m6A修飾的比例會呈現不同的狀態，mRNA的相關研究中就表明絕大部分的mRNA分子被m6A修飾的比例不會高於50%。circRNA中m6A修飾的比例是怎樣的情況呢？為有效的度量circRNA中m6A修飾的比例，作者設計了一個量化指標：

通過分析eluate/(eluate + supernatant)這一比值衡量特定circRNA被m6A修飾的比例，為實現eluate ，supernatant及total RNA數據間的可比性，需要用內標記的方法進行數據歸一化（normalization）。

總體而言，Hela中circRNA被m6A修飾的中位比例要高於hESCs，主要原因是Hela中存在一類能被高度m6A修飾的circRNA分子。而circRNA被m6A修飾的總量來看，hESCs略高一點。

之前的研究報道表明m6A修飾往往促進mRNA的降解，那麼在circRNA中m6A修飾與circRNA的丰度對應關係是怎樣的呢？從數據分析的結果來看，Hela中m6A修飾與circRNA的表達量呈現正相關關係。hESCs中高m6A修飾的circRNA也與Hela中一樣，而低m6A修飾的circRNA中卻表現為負相關。因此作者認為在m6A修飾水平較低的時候，m6A修飾可能會導致circRNA的減少，而當m6A修飾程度達到0.3後，高水平的m6A修飾對應於高丰度的circRNA含量。

圖8 circRNA被m6A修飾的程度分析（來自[1]）

circRNA中m6A修飾形成條件分析

作者分析了m6A修飾的circRNA對應的基因組特徵，發現存在m6A修飾的circRNA所對應的基因組區域兩側往往存在轉座元件。

圖9 m6A修飾的circRNA兩側存在轉座元件（來自[1]）

circRNA的m6A修飾酶方面，作者針對METTL3 和METTL14進行了RNA干擾實驗。結果表明分別針對它們進行RNA干擾即可明顯影響circRNA的m6A修飾狀態，說明circRNA中介導m6A修飾的修飾酶與mRNA的情況類似，也是由METTL3 和METTL14介導的。

circRNA的m6A修飾識別酶方面， RIP-Seq實驗表明YTHDF1和 YTHDF2都是circRNA的m6A修飾識別酶。mRNA中AGO2也可以識別m6A修飾並導致RNA降解，但在circRNA中，AGO2結合的比例 相對較低。

圖10 YTHDF1和 YTHDF2都是circRNA的m6A修飾識別酶（來自[1]）

m6A修飾的circRNA所對應的mRNA更不穩定

在mRNA的相關研究中，YTHDF2結合m6A可調控進RNA的穩定性，那麼在circRNA中情況是怎樣的呢？比較分析後發現m6A修飾的circRNA所對應的mRNA穩定性要低於沒有m6A修飾的circRNA所對應的mRNA。YTHDF2的結合與該過程有關。

圖11 m6A修飾的circRNA所對應的mRNA更不穩定（來自[1]）

本文大大提高了我們對circRNA中m6A修飾的認識，尤其是發現了circRNA存在細胞特異性的m6A修飾狀態，暗示了circRNA中也存在表觀轉錄組學的規律和機制，為進一步探索circRNA中m6A修飾提供了重要的線索。

本文最大的貢獻是發現了細胞特異性的circRNA m6A修飾狀態，但機制解釋不是非常清晰，並沒有專門針對circRNA中m6A修飾的形成條件和機制展開探索。所選擇的實驗材料也不是非常合理。這也正好為進一步系統分析circRNA中m6A修飾的細胞特異性的分子機制，生理和病理意義等科學問題提供了機會。山人認為可以從以下幾個方面進行進一步的探索：

（1）circRNA m6A修飾的分子機制：m6A的修飾酶，識別酶和去修飾酶是否一定與線性RNA完全一致？

（2）細胞特異性circRNA m6A修飾的形成機制，為什麼會出現同一circRNA分子在不同細胞中m6A的修飾狀態會有差別？這意味著什麼？是否存在永遠不會被m6A修飾的circRNA分子？

（3）是否存在疾病或生理活動特異性的circRNA m6A修飾行為？

（4）circRNA中存在circRNA特有的外顯子，這類circRNA的m6A修飾是怎樣的？這些circRNA特有的外顯子與經典外顯子的m6A修飾有沒有差別？

參考文獻：

1. Zhou, C., et al., Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific Methylation Patterns that Are Distinct from mRNAs. Cell Rep, 2017. 20(9): p. 2262-2276.

2. Yang, Y., et al., Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res, 2017.

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