孕激素受體對骨量積累的性別依賴效應及成骨細胞階段特異效應

期刊年卷：Journal of Bone and Mineral Research, Vol. 32, No. 9, September 2017, pp 1841–1852

作者：Zhendong A Zhong,Alexander Kot, Yu-An E Lay, Hongliang Zhang, Junjing Jia, Nancy E Lane, and Wei Yao.

譯者：丁悅 彭芃（中山大學孫逸仙紀念醫院骨外科）

背景介紹:

不同性別之間的骨形成和骨丟失具有差異性。相較女性而言，男性的骨峰值(BPM)更高，骨骼尺寸更大。女性進入更年期和衰老期後骨質流失會加速，這主要是由於女性體內雌激素水平下降，從而導致了骨量減少和骨質疏鬆症發生的風險提高。性激素通過與核激素受體超家族的成員結合從而作用於靶細胞。已經有大量的實驗通過全身敲除或者組織特異性敲除的小鼠模型來研究雌激素受體(ER)和雄激素受體(ARs)對骨骼內穩態的作用。例如，在男性骨骼發育期間，雌激素通過雌激素受體α(ERα)刺激骨膜擴張，而雄激素通過雄激素受體(AR)作用於成骨細胞和骨細胞以增加小梁骨形成。然而在女性骨骼發育中，雌激素通過ERa抑制骨膜發生、皮質內骨吸收和軟骨細胞重塑，導致骨骺的早期閉合和骨擴張的衰減。

孕激素對骨形成的影響仍未明確，現有研究大多使用孕酮激動劑或拮抗劑來評估其在臨床中對骨量的影響。用孕酮激動劑或拮抗劑實驗可能會影響其他激素水平，包括雌激素，雄激素和促卵泡激素(FSH)等等。也有研究者選用了高骨量表型的孕激素受體(PR)種系敲除(PRKO)小鼠進行研究。與野生型(WT)小鼠相比，雌性PRKO小鼠的骨形成量較高，而雄性PRKO小鼠的骨吸收量較低。基於已有的報告，我們假設孕激素受體可以直接參与骨形成和骨量積累的調節。實驗者分別選用了以下三種能敲除孕激素基因(PRcKO)的骨組織特異性驅動子：Prx1-Cre，其靶向細胞為早期的骨髓間充質幹細胞(MSC);Dmp1-Cre，靶向細胞為骨細胞和間充質譜系細胞亞群;骨鈣素-Gre(Bglap-Cre)，主要靶向細胞為成熟成骨細胞。

實驗方法及結果：

圖1

實驗者構建了雜交小鼠系以研究孕激素受體在骨組織的分布特徵。實驗者構建了PR-Cre;Ai14D;Col1a1-GFP小鼠，該小鼠表達孕激素受體的細胞表現出紅色熒光，而成骨細胞/骨細胞則顯示為綠色熒光。在分化過程中表達孕激素受體的成骨細胞則表現為黃色熒光覆蓋。收集3?8周齡的PR-Cre/Ai14D/Col1-GFP小鼠的右股骨遠端;製成冷凍切片。

成骨細胞譜系可表達孕激素受體(PR)基因，特別是在成骨細胞前體中表達明顯。實驗者在3周齡小鼠遠端股骨的骨表面以及生長板軟骨區域內觀察到孕激素受體(PR)表達所對應的紅色熒光。在8周齡時，在生長板，骨內表面和骨髓內可觀察到紅色熒光(圖1A，B)。在海綿狀骨表面可觀察到，3周齡時有4±1%表達孕激素受體的細胞同時表達為黃色熒光;到8周齡時有63±9%的PR表達細胞同時表達黃色熒光(圖1B)。此外，實驗者分別取1、2、6月齡的小鼠的遠端股骨總蛋白，用蛋白質印跡分析法檢測PR蛋白水平。兩種性別的小鼠骨組織均主要表達PR-B蛋白，且隨著年齡的增長，PR-B蛋白的表達迅速下降(圖1D)。收集2個月齡的小鼠的BMSCs，並促進其分化形成成骨細胞，在分化期間的第0,1,2,3和6天收集RNA進行RT-PCR分析。在雌性小鼠中BMSCs開始分化為成骨細胞時，PR表達開始迅速下降。而在雄性小鼠中，PR在早期持續表達(第1至3天)，然後隨著BMSCs進一步成熟形成成骨細胞而減少(圖1E)。實驗者從顱骨和骨髓中分離出成骨細胞樣群體，在體外用成骨培養基促進其分化形成成骨細胞，並在不同時間點提取RNA。PRmRNA水平在培養第0天時最高，並且隨著細胞成骨分化而迅速下降(圖1F)。

圖2

敲除早期骨細胞中的孕激素受體基因(通過Prx1標記)，可以提高骨小梁的骨量並促進骨形成，並具有性別特異性。實驗者條件性敲除了骨髓間充質幹細胞中的PR基因，構建了Prx1;PRcKO小鼠系。Prx1;mT/mG報道模型證實了Prx1-Cre在長骨中的軟骨形成細胞和成骨細胞中均有活性。收集野生型小鼠及雜合系(PR-flox/t)或純合系(PR-flox/flox)Prx1; PRcKO小鼠的股骨蛋白，用蛋白印跡實驗分析證實了Prx1;PRcKO小鼠的骨組織已經成功敲除孕激素受體，在股骨軸上檢測不到PR表達(圖2C)。6月齡的雄性小鼠與同齡雌性小鼠相比，血清孕酮激素水平明顯較低。2-6月齡的Prx1;PRcKO小鼠和野生型小鼠(對照組)相比，血清孕酮激素水平沒有統計學差異。2月齡的雄性Prx1;PRcKO純合子小鼠的BMSCs中的間充質幹細胞樣細胞(CD105tCD29tSca1tCD45–)水平比野生型小鼠的同種細胞水平高40%。(圖2E).

圖3

基因敲除小鼠的股骨遠端的BV/TV值高於野生型小鼠。兩種基因型的老鼠相比，通過mCT測量的股骨中軸骨量或骨骼體積沒有差異，通過三點彎曲試驗評估的股骨長度和機械性能沒有差異。無論何種性別或基因型，小鼠股骨遠端的骨小梁骨體積在兩個月時均達到峰值，並在之後隨著年齡的增長而下降(圖3)。在2個月大時，雌性和雄性基因敲除小鼠的股骨遠端股骨的BV/TV值分別比野生型小鼠高51.5%和85%，在6個月時，雌性和雄性基因敲除小鼠的股骨遠端股骨的BV/TV值均比野生型小鼠高40%。這些增高的比值主要體現在骨量(BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)的增加，而不是總體積(TV)增加(圖3A，B)。

圖4

骨形成加快促使Prx1;PRcKO小鼠表現出高骨小梁骨量表型。骨形成動態組織學分析顯示，2個月齡大的雌性Prx1;PRcKO小鼠與野生型小鼠相比，礦物結合率顯著提高，基於表面的骨形成速率增快，破骨細胞表面積減少。2月齡的雄性基因敲除小鼠與野生型小鼠相比具有較高的礦物結合率和骨形成率。6個月大的雄性Prx1;PRcKO小鼠與野生型小鼠相比具有較高的血清骨鈣素，礦物結合率和骨形成率(圖4A-C)。通過血清CTX1水平測量的破骨細胞活性水平在突變體小鼠和野生型小鼠之間沒有明顯差異(圖4C)。

圖5

為了探究在間質細胞譜系中靶向敲除孕激素受體所引起的高骨小梁骨表型是否具有配體依賴性，實驗者在2個月大的野生型小鼠和基因敲除小鼠上進行卵巢切除術或睾丸切除手術。性腺切除術後1個月，由於老化或性腺激素缺乏引起的股骨遠端骨小梁骨丟失率在野生型小鼠和Prx1;PRcKO小鼠之間沒有差異(雌性小鼠的術後表現為圖5A;雄性小鼠的術後表現為圖5B)。小鼠在2個月到3個月大時骨皮質約增長5%，但與基因型和激素狀態無明顯關聯(圖5C)。

圖6

Dmp1-Cre;mT/mG記錄模型小鼠條件性敲除骨細胞的孕激素受體後(用Dmp1標記)，可以促進骨形成和骨小梁骨量的適度增加。Dmp1標記的細胞包括有骨小梁和骨內膜表面的成骨細胞，破骨細胞和骨細胞(圖6A)。這些結果證實了其他關於Dmp1可能標誌著骨細胞以外的廣泛細胞群體的報告。2個月大和4個月大的突變體小鼠和野生型小鼠的股骨遠端骨小梁BV/TV值和股骨中段皮質骨量在不同性別之間有統計學差異，但基因型之間沒有明顯差別(圖6B)。2個月大和4個月大的不同基因型小鼠的動態組織形態學分析顯示小梁骨表面的礦化表面和骨形成率沒有明顯差異(圖6C)。破骨細胞表面在不同基因型之間也沒有統計學差異。2個月大的雌性Dmp1;PRcKO小鼠的股骨最大負荷量高於野生型;而4個月大的雄性Dmp1;PRcKO小鼠的股骨最大負荷量高於野生型。這些數據表明，Dmp1;PRcKO突變小鼠表現為骨質量適度增加的表型。

條件性敲除成骨細胞中的PR基因(由Bglap標記)不影響小鼠的骨表型和骨轉換指標。使用Bglap-Cre驅動劑在成熟成骨細胞和少量軟骨細胞中選擇性敲除PR，在6個月時不同基因型小鼠遠端股骨骨骼質量、骨形成指標(骨鈣素)和骨吸收指標(CTX-1)均沒有明顯差異。成熟成骨細胞中的孕激素受體缺失不會影響骨質量或骨轉換指標。

實驗結論：

當條件性敲除間充質幹細胞(MSC)的孕激素受體基因時，基因敲除小鼠的骨小梁體積增大，礦物結合率增高，骨沉積量增多。可以用骨髓間充質幹細胞的數量增加及成骨分化能力增強來解釋這一現象。其中雄性小鼠的成骨潛能能力增強較為明顯。Prx1;PRcKO小鼠和野生型小鼠的年齡相關性小梁骨丟失率沒有明顯差異。兩種基因型小鼠在快速骨生長期缺乏性激素都會發生快速骨質丟失。使用骨鈣素-Cre(Bglap-Cre)在成熟成骨細胞中條件性敲除孕激素受體時，觀察到小梁骨質量無明顯差異。此外，三種孕激素受體敲除(PRcKO)小鼠的皮質骨質量與野生型小鼠相比均沒有差異。總而言之，早期骨祖細胞中的孕激素受體失活能對小梁骨增長造成性別依賴效應，但成熟成骨細胞中孕激素受體失活則對骨量增長沒有影響。成骨細胞譜系細胞中的孕激素受體缺失不會影響骨皮層的骨量。

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