「專家觀點」復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任郭瑋：液體活檢臨床應用的熱點和思考

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近年來，隨著科學研究的深入與檢測技術的發展，伴著腫瘤靶向藥物治療的精進與精準醫療的熱潮，液體活檢因其無創性、準確性、動態性及其可行性受到了極大關注，這些特點讓掌握腫瘤的發生髮展動態過程成為可能，恰恰也是醫療大數據、精準醫學和個性化治療迫切需求的。

液體活檢在臨床應用中主要是循環腫瘤細胞(CTC)和循環腫瘤核酸(ctDNA)。CTC的理念提出最早，轉化應用於臨床也初見成效，但是近年來其進一步臨床應用受到了挑戰，而ctDNA在腫瘤靶向治療中迅速崛起。

近日，2017年全國檢驗醫學學術大會在美麗的杭州順利召開，其中液體活檢分會場備受矚目，復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任郭瑋教授帶領我們共同探討了液體活檢在腫瘤診療中的熱點和思考。

1、伴隨診斷，治療監測

基於外周血的液態活檢有利於臨床在腫瘤患者治療過程中實施多點，動態的連續監測。在眾多液態活檢指標中，循環腫瘤DNA（ctDNA）的諸多特徵決定了其更符合監測的臨床需求。例如較短的半衰期、全面的信息覆蓋能力以及ctDNA突變丰度的變化與腫瘤負荷相一致等特點。

以靶向治療耐葯監測為例，由於ctDNA包含了大量腫瘤細胞來源的，決定腫瘤特性（包括藥物敏感性）的遺傳學特徵，再加上高靈敏的ctDNA檢測技術，動態的耐葯突變監測能有效的幫助臨床醫生在影像學發生改變之前，更早期發現耐葯克隆的演化，並輔助臨床醫生及時對症下藥，精準地調整治療方案。

相比常規的血清腫瘤蛋白標誌物，如CEA，CA199，ctDNA在特異性、靈敏度，後續治療的指導性方面都遠超前者。值得提出的是，雖然相關臨床應用可行性已經在部分探索性研究中得到了有力的支持。但諸如ctDNA產生的機理到底為何；血漿ctDNA和正常的cfDNA如何有效的區分；如何用一種比較標準化的手段來衡量不同生物信息演算法的結果（ctDNA對生物信息學的要求較ctc更為依賴）等，有待於更系統、更深入的臨床研究。

2、血檢先行？

第三代EGFR-TKI藥物奧希替尼，是推動ctDNA臨床應用最有力的推手。在奧希替尼誕生之前液體活檢只是作為組織活檢的有效補充，奧希替尼伴隨診斷T790M的檢測使得液態活檢一躍成為相關臨床檢測路徑上的優選，真正地實現了血檢先行。

由於奧希替尼針對的是一代TKI藥物耐受的晚期非小細胞肺癌患者。作為獲得性耐葯突變的T790M無法從原有的組織檢材中檢出，而二次穿刺或支氣管鏡活檢無論是在患者接受度、活檢成功率，活檢併發症風險上都充滿挑戰，利用ctDNA進行的非侵入性的T790M檢測則有效地解決了上述臨床痛點。

2017年NCCN非小細胞肺癌診療指南中對T790M檢測的相關臨床應用給出了具體的路徑。其中提出『在組織活檢不可行的情況下，可考慮行血漿ctDNA檢測。如果T790M為陰性，則再次建議患者行組織活檢』。而在EMSO的相關指南中則更是明確了在該檢測上血檢的優先權。

指南的描述充分體現了兩個層面的信息，也代表了ctDNA臨床應用的兩個特點，一個是ctDNA檢測具有高特異性，因此有它即可，才能先行；二個是ctDNA檢測相比組織活檢，仍有相當的假陰性比例，組織活檢結果仍對於最終藥物使用起到決定性價值。

綜上所述，在診斷標準層面，組織活檢仍是金標準，但在檢測方法上血檢和組織活檢是互補的兩種方法；在臨床應用路徑上，具體誰先行，需結合具體情況進行選擇。

3、如何看待血漿ctDNA結果與組織活檢不一致

涉及到與組織不一致的情況的影響因素有很多。因此應從多方面看待ctDNA與組織活檢檢測結果：

1）病人狀態：患者的病情狀態，如臨床分期，腫瘤負荷大小，處在治療的不同階段等均決定了ctDNA的檢出率。早期的，腫瘤負荷較低的，有效治療後的血漿中cfDNA的總量和ctDNA的水平都相對較低。上述情況下檢測ctDNA，更易發生組織陽性，而血漿陰性的情況。

2）腫瘤異質性:患者腫瘤內部的異質性越大——這種異質性的根源既可以來自於腫瘤自身的演化如轉移，也可以來自於外界的選擇壓力如藥物治療，單點的組織活檢越不能反應整個腫瘤灶的情況。而相比之下，ctDNA來源的腫瘤克隆更多元化，更能反映腫瘤全貌，但也更易發生血漿陽性，組織陰性的情況。

3）檢材質量：標準規範化的采血，血漿製備，ctDNA提取，ctDNA儲存的標本對ctDNA最終檢測結果至關重要。例如不同類型的采血管會影響ctDNA的吸附性損失，血漿製備的時間窗會影響到ctDNA降解及背景gDNA的污染，抽提過程中各種長度ctDNA的回收效率，這都會影響到ctDNA突變的檢出率。

4）檢測方法：檢測技術類型的內在局限性（如檢測下限），檢測平台的性能（靈敏度和特異性）、方法適用性（能檢測的突變類型，對檢測熱點突變和de novo突變的檢測能力）、實際操作（人員的操作能力，主要體現在重複性上）都決定了ctDNA突變的檢出情況。

5）數據分析：生信分析（主要側重點在NGS）、結果判讀（數字PCR，ARMs和MALDI-TOF）、標準建立（NGS，數字PCR和ARMs等其他方法均需要建立自己特定的體系。缺乏客觀，統一的數據分析標準，導致了數據分析方法的多元化，也會影響了ctDNA突變的檢出。

上述的不一致性，整體上看一部分來自於生物學原因，但相當一部分是源於ctDNA檢測目前尚缺乏系統、標準、規範化管理所導致的，後者對於臨床實驗室還是對於監管部門都是極大的挑戰。

4、液體活檢標本類型的多樣化

除了現在提及最多的血漿，包括之前臨床已經開展的胸水EGFR檢測，無論是腦脊液和尿液均可作為液體活檢標本的類型。隨著埃克替尼以及奧希替尼均被證實具備穿透血腦屏障直接作用於腦部腫瘤的能力，腦脊液ctDNA的檢測無論是指導靶向用藥策略還是判斷腫瘤的來源均具有極高的臨床價值。相比較而言，取材最為方便的尿液，實現真正的自主採樣，無創檢測，尤其適合開展定性的突變監測。考慮在單一樣本類型檢測結果與臨床不符的情況，結合多標本類型進行檢測可能具有更好的臨床應用前景。

5、選擇最合適的液體活檢方法

選擇合適的液體活檢方法，應優先應考慮臨床應用場景，應用場景決定了檢測的靈敏度，檢測周期，檢測成本等需求，從而有助於我們匹配不同檢測平台的特點進行綜合考慮。例如：1）治療監測/微小殘留病灶/早期診斷-血漿（靈敏度高的方法學，需具備定量分析能力），2）初次用藥選擇-組織（靈敏度相對低的方法學，定性即可基本滿足需求）+血漿（靈敏度高的方法學，定性即可基本滿足需求），等場景）。

平台本身的性能：操作繁易程度，突變位點覆蓋率，實驗TAT，標本用量。檢測靈敏度和特異性，LDT/商品化試劑盒。

6、試劑盒？LDT？

液體活檢試劑盒一般應滿足以下幾個IVD行業試劑盒的特點：1）設備精準 2）數據信息化 3）試劑簡單化 4）質控標準化 5）操作簡易化 6）產品智能化 7）結果專業化 。目前幾乎所有的檢測平台（NGS、ddPCR、ARMs、MALDI-TOF和BEAMing）均有配套的檢測試劑盒，其中NGS會有眾多廠商提供的不同的文庫製備試劑盒，到了終端測序儀則會有統一的試劑提供。根據檢測試劑盒中所提供的SOP進行規範化操作即可完成一次檢測，無論是NGS還是ddPCR和ARMs等，試劑盒的操作均經過大規模的批量性能測試和監管層的嚴格評估。對於臨床實驗室而言，試劑盒的最大優勢即標準化，在檢測人員技術過關，儀器穩定的情況下，結果的優良主要取決於檢測試劑盒本身的性能。

鑒於數字PCR平台本身的反應原理近似於qPCR（Taqman探針），條件研發能力和平台應用能力相對要求較低，在可預見的一段時間，該平台會成為臨床實驗室開展LDT的優先選擇。這裡需要提出液體活檢LDT的規範管理包括：1）創新和發展，科學合理監管 2）醫學檢驗部門負責人應該對開展LDT負主要責任 3）正式對臨床開展前應完成檢測性能與臨床應用評估 4）完善室內質量控制體系 5）編寫相應的從標本採集到結果解釋全過程的規範化操作規程 6）密切和臨床醫生溝通合作，共同做好結果解釋工作。因此，相對商品化試劑盒而言，LDT需要做的更多，對實驗室的檢測能力以及管理水平均提出極大的挑戰。

總之，在試劑盒還是LDT的選擇上，諸如NGS、ARMs、MALDI-TOF和BEAMing的LDT均具備較大的難度，相對而言ddPCR或許是適合開展LDT的平台。

7、規範操作流程 重視結果解釋

規範操作流程

1）采血管與保存、前處理:離心、抽提、運輸。

2）操作步驟: 合適的質控品選擇，恰當的質控點設置（如抽提的質控，檢測過程中的質控（NGS還會涉及到部分環節設定的質控，如qubit定量，片段分析等））、標準化SOP流程的制定。

3）人員規範培訓：人員的操作規範、實驗室環境監控和儀器設備維護保養。

重視結果解釋

1）臨床可報告範圍：這包含了兩個層面的考量，什麼樣的突變可報——尤其是對於NGS 這類高通量突變檢測平台；什麼量的突變可報——尤其是對於檢測靈敏度特別高的平台。相關原則的設立，應依賴和醫生長期合作以及大量詢證醫學證據的基礎上獲得的。

2）結果報告規範： 給出鹼基的變化-氨基酸的變化，具體變化對應的臨床含義。具備定量分析能力的儀器，應報告具體的拷貝數以及突變丰度：『突變/(野生+突變)』。

3）檢測位點特性：常見的包括突變/缺失/拷貝數變異/融合等，均需按照標準的格式進行標註。

液體活檢作為一項富有挑戰性的新技術，檢測外周血液中來自於腫瘤細胞的ctDNA和CTCs等，具有採樣方便、無創、反映腫瘤全貌、可連續多次監測等優勢，可廣泛用於腫瘤診斷分型、治療用藥的藥物敏感基因檢測（藥物治療伴隨診斷）、病情監測和預後評估等，實驗室須規範操作流程，重視結果解釋，加強臨床與檢驗的溝通。產、醫、研多方緊密結合共同推進液體活檢在醫學診療的迅猛發展。

關於郭瑋主任：

郭瑋，復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任。畢業於上海醫科大學醫學檢驗專業。博士、博士生導師。

社會任職：中華醫學會檢驗醫學分會第九屆委員會青年委員會委員、上海市醫學會檢驗醫學分會第十屆委員會委員、上海市抗癌協會檢驗醫學專業委員會副主任委員、中華醫學會檢驗醫學分會臨床生化學組成員、上海市醫學會檢驗醫學分會質譜學組組長、《檢驗醫學》等多本雜誌編委。

主要成就：近年來主持國家自然科學基金、癌變與侵襲原理教育部重點實驗室開放課題基金、上海市科委基金、上海市衛生局基金多項；參與完成「十二五」國家科技支撐計划子課題、衛生部醫政司課題、國家自然科學基金、國家科技重大專項課題多項，曾獲上海市醫學科技獎二等獎，申請國家發明專利並已授權兩項。在國內外統計源期刊發表論文70餘篇，以第一作者或通訊作者在Clinical Cancer Research、BMC Cancer、Clinica Chimica Acta、CCLM、Hepatology Research等雜誌上發表液體活檢和腫瘤標誌物臨床應用的研究論著，主編、參編專著7部。

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