《科學》：魔剪快速靶向！CRISPR/ Cas9基因編輯系統需滿足這個條件！

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細胞定位由單鏈寡核苷酸指定的特定染色體DNA序列有多快？為了解決這個問題，研究人員調查Cas9蛋白在細胞內搜索過程，可以通過gRNA來編程，以結合基本上任何的DNA序列。這種靶向靈活性要求Cas9解開DNA雙螺旋，以測試與gRNA的正確鹼基配對。研究發現：一個熒游標記的dCas9需要6小時才能找到正確的靶序列。實驗發現：Cas9及其gRNA在高濃度存在的情況下，可以實現快速靶向。

CRISPR / Cas9基因編輯系統的優勢在於其靶向機制的內在靈活性，但是也存在著內在性的搜索和剪切緩慢的缺點。 而導致這個缺點存在的機制是由於在細菌的細胞中，指導蛋白gRNA（編碼蛋白質的RNA）在最終到達目標DNA序列之前，需要花費一個很長的時間去尋找目標基因組，這個過程長達6個小時。 烏普薩拉大學的研究人員在實驗中發現：這個慢動力學的問題可以通過一種新的方法來解決，那就是使用高濃度的gRNA和Cas9。

這篇論述提高CRISPR / Cas9基因編輯系統速度的文章發表在9月29日的《科學》雜誌上面，論文題目為「Kinetics of dCas9 Target Search inEscherichia coli.」

文章作者寫道：「Cas9必須將搜速的每個位點都解開才能夠進行工作。我們通過結合單分子熒光顯微鏡和大容量限制保護測定法，來研究活體大腸桿菌中催化無活性Cas9（dCas9）搜索的機制。我們發現一個熒游標記的dCas9需要花費 6小時才能找到正確的目標基因序列，這意味著每個潛在的目標搜索時間被限制在少於30毫秒。」

在最初設計實驗的時候，研究人員使用這兩種方法來測量Cas9需要多長時間才能找到其目標序列。 第一種方法顯示：在細菌中，Cas9需要長達6小時的時間來搜索目標基因，即通過400萬個鹼基對來完成搜索。這種看起來不太靠譜的結果也可以通過第二種獨立技術來驗證。發現的時間與Cas9可用於測試每個位置的毫秒數量相關，研究人員可以通過實時追蹤標記的Cas9分子來測量Cas9用於測試每個位置所消耗的真實時間。

該研究的資深作者Johan Elf博士說道：「我們的研究結果顯示：Cas9有更大的靈活性的同時，付出的代價是花費更多的時間。因此我們覺得：為了更快地找到目標，是否可以使用更多的Cas9分子尋找目標DNA序列。」

「大多數搜索DNA代碼的蛋白質只能通過感測DNA雙螺旋的外部來識別一個特定的序列，」Elf博士繼續說道，「Cas9可以搜索一個任意DNA代碼，但是要確定它是否在正確的位置，這就導致Cas9分子必須打開雙DNA螺旋，並將序列與編程代碼進行比較。而我們在研究中發現了一個令人難以置信的事情：Cas9分子在不使用任何能量的情況下仍然可以搜索整個基因組。「

提高Cas9分子的濃度可以幫助研究人員在合理時間範圍內找到正確的DNA序列，這可以解決目前科學家們在細胞研究中急需解決的幾個重要問題。在我們的研究中，我們了解到了 Cas9分子搜索目標DNA序列過程的性質，這就為科學家們提供了一條如何改進系統的重要線索。

我們之前太過於強調Cas9分子的靈活性，但是，如果我們犧牲Cas9分子一部分的靈活性，但是它仍然有足夠的能力用於編輯各種基因，而這樣做的好處就在於：這樣會提高Cas9分子搜索的速度，可以更快的使其應用於臨床。

Elf博士說道：「我們的研究結果給我們提供了一條很重要的線索——可以幫助我們如何實現Cas9分子更快速的檢測DNA序列，以期推動其在醫學上的使用。「

解決這個問題的關鍵在於PAM （原始相鄰基序「序列」），它們決定了Cas9分子打開DNA雙螺旋的位置和速度。不需要打開DNA分子螺旋結構的分子剪刀不僅可以更快的找到目標基因，並且還會降低基因編輯副作用的風險。

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