華人首次發現絲狀病毒顆粒殼體化雙鏈RNA病毒！

編者按：

近日，Nature雜誌子刊Nature Communications刊登了華中農業大學植物科技學院王國平教授研究團隊的論文《一個有絲狀病毒顆粒的雙鏈RNA病毒》，碩士生莢恆霞為第一作者。該研究首次揭示了線性雙鏈RNA病毒由細絲狀顆粒包裹，也是迄今報道的最長的病毒顆粒，也揭示了它可能處於從正單鏈RNA進化到雙鏈RNA病毒的中間狀態及與其他雙鏈RNA病毒不同的進化機制。這項工作首次報告了山茶炭疽菌絲狀病毒1（CcFv-1）的線性雙鏈RNA病毒的形態及進化特徵，也為雙鏈RNA病毒殼體化的機制提供了新的思路。

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研究人員首先從湖北宜昌的茶葉中分離出山茶炭疽菌LT-3-1株 和 DP-3-1株，又把菌絲接種於玻璃紙膜在PDA平板25℃黑暗中4-5天，然後收集保存於液氮中。這些收集物被用於雙鏈RNA提取和蛋白質消除。雙鏈RNA隨後被除去剩餘核糖體的RNA和DNA及進行了酶處理。

為了純化病毒顆粒，菌絲粉末混合於磷酸鹽緩衝液，離心12096×g 30 min以除去細胞碎片。研究者進一步超速離心上清物，沉積物用PB緩衝液收集。這個粗提物用蔗糖密度梯度離心進行病毒純化。純化的病毒顆粒用1%乙酸雙氧鈾負染在碳包被的400個網眼的銅網格上，且用透射電子顯微鏡檢查，用ImageJ 1.43進行了顆粒長度和寬度的測量。

圖1 從山茶炭疽菌LT-3-1株提取的病毒樣顆粒的透射電鏡圖像

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接著，研究者進行了克隆和測序（圖2）。雙鏈RNA的互補DNA的全長由每個單獨純化的雙鏈RNA擴增（RT-PCR）得到的部分cDNA的裝配及cDNA末端快速擴增法（RACE）決定。分析結果表明雙鏈RNA1-8是山茶炭疽菌LT-3-1株（一個新的雙鏈RNA病毒）的基因組成成份，研究者將其命名為山茶炭疽菌絲狀病毒1（CcFv-1），因其病毒體的形態。

圖2 雙鏈RNA1-8 的編碼鏈的末端區域的多重比對

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研究者又對病毒顆粒的雙鏈RNA和蛋白質進行了分析。用瓊脂糖凝膠電泳分析核酸，用12%SDS-PAGE分析蛋白質。蛋白的膠在電泳後，用考馬斯亮藍染色，蛋白條帶被單獨地切割再進行PMF分析。

進一步，研究者進行了多克隆抗體產生和免疫吸附電鏡實驗（圖3）。他們從山茶炭疽菌絲狀病毒1（CcFv-1）感染的株LT-3-1提取出P4蛋白，且用蔗糖密度梯度離心純化。SDS-PAGE分離之後，包含P4的膠帶被切離用於抗體準備。總共300μg P4蛋白分四次注入兩隻三周大雌性BALB/C老鼠，以產生多克隆抗體（PAb-P4)。從CcFV-1感染和沒感染的分離株準備蛋白，提取於蔗糖密度梯度離心後的蔗糖片段。這些蛋白用直接ELISA法和稀釋範圍從1：50到1：512，000的多克隆抗體反應，以估計最佳滴度。他們還應用了Western-blotting和免疫吸附電鏡實驗。

圖3 抗CcFV-1 P4的一個多克隆抗體的滴度定量和Western blot 分析（a）及病毒顆粒的免疫吸附電鏡分析（b-d）

研究者還進行了CcFv-1雙鏈RNA的消除實驗。山茶炭疽菌LT-3-1株的菌絲在PDA上25℃生長在一個24小時的光周期下長達1個月，直到孢子形成。培養末期，分生孢子被收集，且培養於PDA平板25℃於黑暗中24小時。形成的小克隆分別地轉染於新的PDA平板，用於雙鏈RNA提取。提取的雙鏈RNA用1.2%瓊脂糖電泳分析，用EB染色觀察，用RT-PCR進一步鑒定。

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為分析真菌毒株的生物學特徵，研究者估計了培養了4天的菌絲在PDA上黑暗中再培養3-5天的形態學和生長速率，一式三份（圖4）。毒株的毒力是通過接種菌絲於分開的茶樹葉上來確定的，發生的病變在接種後4天被測量和拍照。

圖4 茶葉上不同山茶炭疽菌毒株的菌落形態、PDA平板生長速率和病變長度

為了用雙鏈RNA和病毒顆粒進行轉染，研究者從活躍生長的LT-3-1D2 株、一個從分離株LT-3-1分生孢子再生的子分離株、或DP-3-1 株來準備原生質體。原生質體被微孔過濾器過濾，使用一個血細胞計數器在100倍的顯微鏡下計數，且被用於雙鏈RNA轉染。總共2.0×106個原生體，用5-7μg酶處理過雙鏈RNA（包含雙鏈RNA1-8）或70-80μg病毒樣顆粒轉染。轉染之後，原生質體的混懸劑用無菌水稀釋，在PDA平板上鋪開用於形成克隆。新克隆分別培養於新的PDA平板，用於雙鏈RNA提取。

綜上，這項研究首次揭示了雙鏈RNA病毒由細長彎曲的顆粒包被，且CcFV-1 的病毒顆粒為目前已知最長。作者還指出進一步的研究需要明確是否存在一個新的基因組包裝機制或者涉及一個新的蛋白質亞單位的排列。

Title:A dsRNA virus with filamentous viral particles

Abstract:Viruses with double-stranded RNA genomes form isometric particles or are capsidless. Here we report a double-stranded RNA virus, Colletotrichum camelliae filamentous virus 1 (CcFV-1) isolated from a fungal pathogen, that forms filamentous particles. CcFV-1 has eight genomic

double-stranded RNAs, ranging from 990 to 2444 bp, encoding 10 putative open reading frames, of which open reading frame 1 encodes an RNA-dependent RNA polymerase and open reading frame 4 a capsid protein. When inoculated, the naked CcFV-1 double-stranded RNAs are infectious and induce the accumulation of the filamentous particles in vivo. CcFV-1 is phylogenetically related to Aspergillus fumigatus tetramycovirus-1and Beauveria bassiana polymycovirus-1, but differs in morphology and in the number of genomic components. CcFV-1 might be an intermediate virus related to truly capsidated viruses, or might represent a distinct encapsidating strategy. In terms of genome and particle architecture, our findings are a significant addition to the knowledge of the virosphere diversity.

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