戰勝不可能：轉錄調控的重大技術進展

撰文 高正良（同濟大學轉化醫學高等研究院、醫學院和同濟大學附屬第十人民醫院特聘教授）

8月24日，Cell雜誌上發表以西南醫學中心徐劍教授和復旦大學周峰研究員為共同通訊作者的文章 「In Situ capture of chromatin interactions by biotinylated dCAS9」，首次利用了「biotinylated dCAS9」的方法建立了高解析度，位點特異原位DNA-蛋白質以及其他元件的互作網路（下圖）（詳見此前BioArt的報道：Cell：中美科學家攜手打開解析基因組非編碼序列的潘多拉之盒丨特別推薦） 。該工作是表觀和基因轉錄調控領域的重大技術進展，一定程度上解決了困擾領域幾十年的技術瓶頸問題，第一次讓領域專家看到解決這個技術瓶頸的希望；假以時日，必將觸發新的技術改進、普及化和科學進展，甚至表觀和基因轉錄調控領域的爆髮式進展（在這個技術的應用中，本文將只關注反式因子研究這一塊，也借回憶一些個人經歷，展現這個問題的歷史與重要性，希望能夠觸發青年學子對於科學和職業的一些有益的思考）。

自從上世紀後半葉以來，人們日益認識到基因是生物的遺傳基礎，而基因表達則是生物表型的內在物質基礎與機理。基因表達的調控，尤其是表觀和轉錄調控更是首當其衝， 日漸成為現代分子生物學、遺傳學和基礎醫學研究的核心內容。基因表達的調控包含諸多維度比如信號轉導，轉錄前（包括染色質構象和表觀調控等），轉錄調控，轉錄後調控（剪切、編輯、轉運等等），翻譯和翻譯後調控。其中多個步驟都是圍繞著基因序列（DNA序列—傳統的認為是順式作用因子Cis）和其結合因子包括蛋白和非蛋白因子（傳統地認為反式作用因子Trans）而發生。因此發現和解析這些DNA序列及結合因子並闡明它們的相互作用關係與機理是基因表達調控的核心內容；發展適當的技術，開展相關的研究則是核心的核心，關鍵的關鍵。如果暫時把高級構象和染色質生物學（近年研究前沿，值得幾篇科普和前瞻性評論，這個領域不少華人學者表現耀眼，比如生物物理所的新秀李國紅研究員等）擱置在一邊，簡單粗暴的分一下，基因的表觀和轉錄調控有兩個層面，順式因子和反式因子，技術方法學也可以簡單粗暴地分為以研究順式因子或反式因子為主的兩類方法學。

對於已知或候選反式因子（表觀和轉錄因子）和順式因子的研究手段較成熟，比如經典的EMSA，報告基因，ChIP等。給定反式因子，如何解析可能的結合和互作的未知順式因子，尤其是在native 狀態，unbiased 的組學水平上，曾經也是巨大挑戰。但是這個難題在世紀之初取得了突破性進展：當時博士來自哈佛Tom Maniatis(美國科學院院士，2012年與 Donald D. Brown共同獲得拉斯克基礎醫學特殊貢獻獎，《分子克隆》的主編，第一個構建基因組DNA文庫，第一個構建cDNA文庫，目前在哥倫比亞大學）實驗室（陳志堅、付向東、吳瑛、吳強等老師都來自這個實驗室）的任兵老師（清華新秀頡偉教授的博後合作導師）正在MITRichard Young院士（當時應該還不是院士）實驗室做博士後，是第一個完成全組學水平轉錄因子CHIP分析的人(Ren et al., 2000)，之後有一大批的華人學者比如阮一駿、趙可吉等等都成為相關方向的翹楚。任兵老師很快去了UCSD，成為領域的靈魂人物（也是冷泉港課程的負責人），The Young實驗室更是在這個技術之後迅速成為年輕一代表觀和轉錄研究者的夢想之地。

2012年拉斯克醫學特殊貢獻獎得主Donald Brown和Tom Maniatis

但是在另外一個方向上 ，即給定順式序列，如何研究在native狀態下與之相互作用的未知反式因子，幾十年來一直是橫亘在研究者面前的holy grail的技術問題，困擾著領域，也充滿了鬼魅的誘惑，俘獲一個又一個激情幼稚的心，我自己就是曾經的不怕犧牲、無知無畏的一個。

05年博士畢業前夕，遍訪美國科學學院院士、HHMI、Top Universities和conference presenters 的網站，決定聚焦剛剛起步的系統和合成生物學，靶向治療的抗性發生、預測與解決，日新月異的非編碼RNA和表觀調控領域，研究很薄弱的剪接調控，垃圾DNA、轉座子、基因轉換等（直到現在還有很多非常有意思的DNA現象，但是卻非常poorly 研究的，比如conversion and convection—可以看看Ting Wu的網站，很少有CNS，甚至所謂的好文章，曾經主要以Genetics 為主打，但是令人敬重的學者）。在舊金山與任兵老師的偶遇部分改變了我的聚焦方向：任兵老師不僅學術好，做人更好（頗有晉商之感哈）；當他知道我是自費出來開會見世面，尋找職業發展機會，免費請我吃了2天飯。就是在這兩天共餐過程中他「不經意」的點撥，讓我開始重新審視自己是否應該不考慮轉錄調控領域。舊金山會議回來後不久在Woods Hole 會議上遇見哈佛大學的馬秋富教授，是神經發育轉錄調控方面的權威，開始更清晰認識到轉錄調控並不是一個over-crowded的方向，仍然是一個poor studied的領域，有很多重大問題沒有得到解決。

後續的閱讀思考中遇到的第一個重大bug問題就是很震驚（幼稚）發現了在native狀態研究給定順式序列的未知反式因子方法學的真空狀態。儘管在非native 狀態，有些方法，比如yeast/mammal cell one-hybrid、oligo array 等在一定程度上可以幫助解析潛在地能夠結合和調控給定順式序列的反式因子，但是對於如煙的基因組的重要基因和位點，居然缺乏一個有效的可以研究其未知結合和調控因子的方法，這個發現足以讓任何一個有科學激情的幼稚頭腦亢奮，就像我當年一樣：基因工程編輯一個特異性的順式序列作為hook就可以了，這麼簡單，怎麼會被人疏忽呢? 很困惑、很亢奮。當時潛在地可以作為hook的已經很多了，比如loxP、FRT、GAL4、MS2等，也可以考慮三鏈結構等（後來還可以用TALEN及Cas9等），還可以考慮做concatemers, 用BAC或者YAC一類的……想了很多可能，信心膨脹，很大程度上影響了我接下來的博後選擇和職業的軌跡。

博後最後面試的是西南醫學中心Jenny Hsieh博士（博士導師RNAi 諾獎Andrew Fire，博後導師Fred Gage）的實驗室，seminar之後，Jenny當即給了offer。第二天在Jenny的辦公室從上午談到下午，有關實驗室規劃、基金潛力、課題和我可能的職業發展與規劃…基本決定不會選擇去西南醫學中心了，Jenny突然拿起粉筆，一邊在黑板上畫一邊說，你覺得這個課題有沒有挑戰性和潛力……Jenny還沒畫完，我就脫口而出，that』s my idea! Jenny 轉過頭: what do you mean? It is my idea！……在Fred Gage院士（SALK，以JHU 宋紅軍為代表的一大批華人學者都與這個實驗室有淵源，也是成體神經再生領域最大的一個pedigree）實驗室Jenny嘗試過這個技術，當時暗想她步驟里有多個不必須的地方，覺得自己的方案會更好。這個共鳴讓我對Jenny實驗室興趣大增，決定回去仔細考慮…最後毅然決定加入…博後起始了多個課題，這個課題比較靠前，也是最快放棄掉的：在具體執行設計中，意識到這在當時是mission impossible；原因很簡單，信噪比和質譜的敏感性，以前之所以亢奮是因為沒有做好基本數學。

在一個雙倍體細胞里，我們大多數人研究和感興趣的順式序列通常都只有兩條，而與它們結合的反式因子（轉錄因子）通常不會超過4-8個分子。轉錄因子常是以同源或者異源二聚體作用，對於給定的順式序列，結合、沒有結合或者是單倍體方式結合，那能夠拉下來的反式因子的數量一般應該在2-4個分子，多可達8個，少可至2，甚至1（想想imprinting）。 而在哺乳動物細胞中，反式因子常常是成千上萬甚至是千萬個分子。也就是說，要在這浩瀚的一團漆黑的汪洋里從成千上萬甚至千千萬萬個一模一樣的微小生物里抓住僅有1-8條口含微小標籤的微小生物，這將需要如何高效精準，恐怕孫悟空的火眼金睛也難以企及…

更悲催的是上述的挑戰只是其中一個難關，事實上這個挑戰本可以激發無數自信心爆棚的分子生物學技術男的征服欲，至少當年我就是這樣，覺得會有一系列的巧妙的辦法或技巧來解決或規避這個問題。而第二個挑戰：質譜的解析度和敏感性，成了壓死絕大多數自信心爆棚的分子生物學技術男的稻草。當時的估計是至少需要1010-12個分子才可能完成這個實驗，相當於103-6（1千-100萬）盤細胞，意味著即便能夠成功，這個技術上也沒有事實上的用處……

所以多年來無數人想到過，Jenny想到了，我也想到了，MITBBS生物版在11-13年間還有過一次還是兩次較為深入的討論（我在這個討論中潑了不少冷水，也許應該向某些人道歉了），無數的激情四射自信心爆棚的分子生物學高手在思考這個問題 …這期間，最值得提到的是2009年的研究，據說是經歷了多年審稿的折磨，來自哈佛大學醫學院的David Kingston的實驗室在Cell上報道了這個技術的雛形(Dejardin and Kingston, 2009)。這篇文章並沒有在領域裡引起波瀾，原因很簡單，是針對有很多個copies的端粒，但仍然用了20升HeLa細胞，大約3X109個細胞。對於單個基因序列而言，他們估計至少需要幾百升細胞才有可能，顯然這個技術對於哺乳動物細胞的蛋白編碼基因的調控序列而言，基本等同於沒有！

相信對於很多Hardcore 轉錄調控的研究者，這個技術問題會像魔鬼一樣一直縈繞在心。2010-2011年，我開始思考和準備自己獨立後的方向，決定選擇當時人跡罕至的幹細胞靜息激活調控，聚焦表觀和轉錄調控圖譜，所以一邊發展ChIP-Seq，自學生物信息分析，一邊又開始琢磨這個技術。那時來自表觀大牛Jerry Workman博士實驗室的李兵已經在西南醫學中心做PI幾年了，成為我的球友和鐵哥們，給我潑了很多冷水也給了不少建議，也是在這個時候我才知道這個技術問題是表觀轉錄實驗室共同的心魔；後來幾年也多次同朋友們討論，但是一直都覺得時機還不成熟……

突然就是8月24日的深夜，看到Cell文章的新聞，非常興奮，亢奮的無法入睡，由衷的為這個技術，為徐劍、周峰和所有的作者高興…在微信和大學教授群里盛讚這個突破。第二天從GJ那裡獲得全文，同朋友交換了一些意見，也從GJ和徐劍那裡得知這個工作的艱辛，由衷的敬佩徐劍、周峰和所有作者的膽識、努力、勤奮、毅力和不放棄！

仔細閱讀全文，技術瓶頸還是相當高的，挑戰仍然在信噪比和質譜敏感性。質譜背景處理上要求比較高，需要技巧；每次試驗需要0.25-1X109個細胞。這個細胞量對於工具細胞不能說太難，但對於絕大部分功能細胞，最需要這個技術體系的研究系統，是極大的瓶頸，對於微量材料比如早期發育的問題更是無法想像。顯然這只是一個開始，徐劍、周峰和合作者們讓大家看到了希望，我們有理由相信真正practical的技術就在拐角了，這個工作會掀起大家新的研究熱情，技術一定會得到改進完善，推廣應用，給轉錄調控領域帶來新的機遇！最後，再次衷心感謝和祝賀徐劍、周峰和所有的作者，great efforts!

作者簡介：高正良教授為上海市特聘教授，同濟大學醫學院高等研究院特聘研究員，上海市第十人民醫院介入研究所常務副所長，目前正負責籌建同濟大學麗豐再生醫學研究院。高正良教授主要從事神經和脂肪幹細胞命運決定和表觀轉錄圖譜及臨床應用、幹細胞組織工程、器官重建、疾病和腫瘤模型等研究，相關成果主要發表在Nature Neuroscience、Nature Chemical Biology、J Neuroscience、Cell Death Dis.等雜誌上。

參考文獻：

1、Dejardin, J., and Kingston, R.E. (2009). Purification of proteins associated with specific genomic Loci.Cell136, 175-186.

2、Ren, B., Robert, F., Wyrick, J.J., Aparicio, O., Jennings, E.G., Simon, I., Zeitlinger, J., Schreiber, J., Hannett, N., Kanin, E., et al. (2000). Genome-wide location and function of DNA binding proteins.Science(New York, NY) 290, 2306-2309.

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