百邁客雲全面解析水稻抗旱分子機制

中文題目：OsbZIP46、SAPK6基因共同過表達提升水稻抗旱能力

研究背景

乾旱是全世界範圍內威脅水稻產量的主要非生物脅迫之一。作物的抗旱性狀一般認為由多基因控制，因此，抗旱相關多基因轉化策略理論上可以作為提高水稻抗旱性的一種有效手段。

脫落酸（abscisic acid,ABA）信號通路在植物非生物脅迫響應網路中處於中心位置，該通路包含4個主要組件：a）ABA 受體PYR/PYL/PCAR，b）A型蛋白磷酸酶2C，c）蛋白激酶SnPK2，d）bZIP轉錄因子家族（第3亞家族）。之前研究表明，bZIP轉錄因子活性在多種植物中可被蛋白磷酸酶SnPK2s通過磷酸化調節。我們之前的研究也表明，bZIP轉錄因子OsbZIP23和OsbZIP46在水稻抗旱過程中扮演著重要角色，且其轉錄調控活性可被SnPKs家族SAPK2與SAPK6激活。因此，bZIP轉錄因子家族與SAPKS蛋白磷酸酶家族可作為多基因轉化策略中的候選基因來提升水稻抗旱能力。

技術路線

材料與方法

材料

轉化基因：OsbZIP46CA1（bZIP轉錄因子OsbZIP46刪除負調控domainD）+ SAPK6（蛋白磷酸酶家族）；

轉化載體：pCB2004質粒

水稻轉化受體材料 ： 東北種植品質KY131

水稻轉基因材料：XL22（OsbZIP46CA1+SAPK6），CA1-OE（OsbZIP46CA1），SAPK6-OE（SAPK6）

RNA-seq材料：XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N4葉齡種子材料，每個處理3個生物學重複

方法

轉化：農桿菌介導轉化

插入片段拷貝數檢測：Southern Blot

插入基因轉錄水平評估：熒光定量PCR

插入基因蛋白表達及活性評估：熒光定量PCR檢測OsbZIP46CA1調控基因Rab21、 Rab16B在轉基因材料中的轉錄水平；轉基因材料對ABA敏感性判斷轉化基因是否正常過蛋白過表達且產生活性

抗旱性評估： 種子發育期，缺水處理7天，恢復給水7天後存活率；生殖生長期，孕穗期缺水處理14天，產量、灌漿速率、穗數、小穗花數等指標

結果

1、轉化株構建與篩選

1）使用MISSA系統構建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重組質粒，採用農桿菌介導轉化方法將兩個抗旱相關目標基因插入東北栽培品種水稻KY131基因中，構建OsbZIP46CA1、APK6雙基因轉化株。另外，也使用同樣的轉化體系分別構建了上述兩個基因的單基因轉化株。

2）通過southern-blot雜交技術，鑒定T0初始轉化株中插入基因的拷貝數，挑選插入基因單拷貝的T0的T1子代初步鑒定具備抗旱性狀的轉基因株（肉眼觀察）。

3）最終篩選得到一個在生殖器官發育階段抗旱強於非轉基因株的雙基因轉化株XL22，見圖1B。

4）利用熒光定量PCR技術，檢查了XL22轉基因株及其對應的單基因轉化株中的插入基因是否過表達，如圖1C所示，上述轉化株中插入基因均出現了預期的轉錄水平。

5）以OsbZIP46CA1的下游調控基因Rab21、Rab16B的轉錄水平，轉化株對ABA的敏感性來判斷插入基因是否發揮作用，如圖1C所示，轉化株中點的Rab21、 Rab16B轉錄水平均出現上調，且轉化株對ABA更加敏感，說明上述轉化株中的插入基因均能正常發揮作用。

2、XL22轉化株抗旱能力評估

a）生殖生長期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）、KY-131-N（非轉基因株）4組材料，每組4個獨立生物學重複，孕穗期缺水處理14天，比較不同材料之間的單株產量、灌漿速率、穗數、小穗花數、圓錐花序數、單位面積產量6個指標。如圖3所示，無論是肉眼觀察（3A、3B）結果，還是上述6個指標（3C）統計結果，都表明XL22在抗旱性上要優於單基因轉化株與非轉基因株。

b）種子發育期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）3組材料（4葉齡），每組3個生物學重複，7天缺水處理，觀察恢復給水7天後的葉片捲曲情況，統計存活率。如圖4A所所示，恢復給水7天後，XL22相較於單基因轉化株，葉捲曲更加輕微，如圖B所示，XL22的存活率也要顯著高於單基因轉化株。另外，如圖4所示，XL22離體葉片子在室內環境下，脫水速度也顯著低於其他材料。該結果表明，XL22在種子發育階段的抗旱能力也要強於單基因轉化株。

3、XL22轉化株耐熱、抗寒能力評估

分別取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4葉齡種子材料，每個3個生物學重複，均進行42℃ 12小時，4℃5天處理，最後正常環境下生長7天，觀察這各材料之間的葉捲曲清苦以及存活率，結果顯示，XL22表現為個更高的存活率（圖5C)，更加輕微的葉片捲曲（圖4A），表明XL22相較於單基因轉化株與非轉基因株擁有更強的耐熱、抗寒能力。

4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子學機制

b）分析結果顯示，XL22的缺水處理相較於正常給水組材料，2977個基因轉錄水平顯著上調，3243個顯著下調；CA1-OE中，2962個基因轉錄上調， 3514個基因轉錄下調；SAPK6-OE中，3433個基因轉錄上調，3472個基因轉錄下調（FDR 2）。大部分的轉錄上調基因在3個材料之間是共有的，如圖6B所示，表明這些上調基因在水稻乾旱脅迫響應中功能比較保守。

c）由於轉基因材料中過表達基因為bZIP家族轉錄因子及其活性激活基因家族，研究者重點關注了3個材料中轉錄上調的基因，這些基因被劃分為4類：Group1，XL22相較於CA1-OE特有上調基因，645個；Group2,XL22相較於SAPK6-OE特有上調基因，500個基因特異上調；Group3，CA1-OE相較於SAPK6-OE特有上調基因，398個；Group4，SAPK6-OE相較於CA1-OE特有上調基因，869個。Group I主要分布在「Response to ABA」、「Regulation of Plant-type Hypersensitive response」等GO term；Group II主要分布在「Organic Substance Biosynthetic Process」 、「Salicylic Acid Biosynthetic Process」 、「Regulation of Hydrogen Peroxide Metabolic Process」等GO term；Group3主要分布在「Gene Expression and Regulation」、 「Nitrate Related Metabolic Process」 、 "Carbohydrate Biosynthetic Process」 等GO term；Group4主要分布在 「Cytokinesis and Cell Proliferation」、「Microtubule Related Process」、「Response to Abiotic Stress」 等GOterm（見圖6C）。因此推測，XL22中的兩個基因可能激活了不同的乾旱脅迫應答基因。

d）為了揭示GroupI 、Group2兩個基因集內部的基因調控關係，研究者基於STRING資料庫分別繪製了上述兩個基因集內部基因的蛋白互作網路圖。如圖7所示，GroupI蛋白互作網路中包含481個PPI（protein-protein intereaction，PPI），Group2中包含280個PPI。其中，有6個基因在蛋白互作網路中均處於非常中心的位置（與之互作蛋白數量越多，越靠近中心位置）。其中，3個（LOC_Os12g13720, LOC_Os03g58800, LOC_Os09g31486) 在兩個蛋白互作網路中均處於中心位置，分別編碼 PDR ABC transporter, a ATPase, and a DnaK/Hsp70s family protein,可能在乾旱應答過調控網路發揮著非常關鍵的；其他3個基因（Group1特異：LOC_Os04g42260 LOC_Os02g38580，Group2特異：LOC_Os05g03050）分別編碼protein phosphatase、Rad51、Hsp90 ，從功能可以看出，它們與水稻乾旱應答同樣相關。

結論

構建了抗旱OsbZIP46CA1+SAPK6雙基因轉化水稻XL22。

揭示了XL22抗旱表型後部分分子調控機制，為之後進一步的分析調控機制研究提供參考信息。

研究中涉及到的轉錄組數據分析，從下機數據質控、與參考基因組比對，到基因轉錄水平定量、差異表達分析，到最後共表達分析、蛋白互作分析，均是該實驗室的同學們在百邁客雲平台的有參轉錄組APP提供的圖形化界面下自主完成的，該步操作無需編程語言基礎，無需linux系統命令行界面下軟體安裝、調試與運行經驗，更重好的是無需等待，基礎分析7天完成，個性化分析幾分鐘人機交互完成1次，你要做的只是網頁下簡單幾步便可完成數據導入、參數設定、任務運行、結果查看、數據後期挖掘等數據分析步驟。快點點擊「閱讀原文」進行註冊吧~

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