復旦楊芃原組等開發精準糖蛋白質組新分析方法

BioArt按：糖基化是最複雜的蛋白後修飾之一，具有多種重要的生物學功能。與其他蛋白後修飾相比，糖基化更為複雜，分析難度很大。目前已有的糖基化分析方法有明顯的局限性：大部分方法僅能分析糖鏈或糖基化位點等不完整的糖基化信息，而基於糖肽的位點特異性分析方法則存在通量低，假陽性率高，數據質量難以評測等問題。9月5日，復旦大學生物醫學研究院楊芃原課題組與中科院北京計算技術研究所賀思敏課題組以及上海蛋白質中心黃超蘭課題組合作，在Nature Communications雜誌上在線發表了題為「pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification」的研究論文，該研究展示了高通量、高質量的完整N糖肽分析流程。該研究為精準糖蛋白質組分析提供了新的分析工具，並提供新的糖肽譜圖質量評估方法以及目前最大的糖肽數據集。

論文解讀：

隨著蛋白質組學和質譜的發展，後修飾蛋白質組的研究大量湧現。其中磷酸化、乙醯化等後修飾的分析技術已經十分成熟。而作為最複雜的蛋白後修飾之一，糖基化分析的技術挑戰也是最大的【1，2】。與其他蛋白後修飾相比，糖基化不但會產生宏觀不均一性（每個蛋白上可能有多個後修飾位點），更會產生海量的微觀不均一性（每個位點上可能有幾十甚至上百種不同的後修飾基團）。除此之外，糖鏈本身的離子化效率很低。這些因素的結合使得糖基化分析的通量和質量遠低於蛋白質組學的常規分析水平【2，3】。

目前成熟的糖基化分析方法因技術的限制，通常只能分析不完整的後修飾信息，例如糖基化位點或者從蛋白上釋放的糖鏈。在此類分析中，重要的蛋白-糖鏈連接信息被丟失【1-3】。完整的糖基化信息需要直接分析完整糖蛋白或完整糖肽（intact glycopeptide）。已有的完整糖肽分析技術存在以下問題：1）通量較低。由於解析完整糖肽需要獲得肽段與糖鏈的信息，人們通常使用多種質譜碎裂技術或者多種實驗技術的組合，從而限制了整體通量【3-5】；2）精度低，假陽性率很高。常規蛋白質鑒定的假陽性率在1%以下，而完整糖肽鑒定數據中的假陽性率甚至會高達20%【6】；3）缺乏質控標準。因為標準糖肽的合成非常困難，完整糖肽分析無法採用標準數據集進行質控評測，從而使得該領域的發展緩慢，數據質量層次不齊。

該研究開發了多種技術，解決了上述完整糖肽分析的三個問題。首先，研究人員廣泛測試了目前最新質譜儀器支持的各種碎裂方式並進行了系統性分析、模擬，最後挑選了經過優化的階梯能量HCD（higher-energy collisional dissociation）作為糖肽的質譜圖採集方法。這種方法能夠獲得豐富的完整糖肽碎片信息，同時保證了數據採集效率。隨後，研究人員開發了具有自主知識產權的完整糖肽檢索引擎pGlyco2.0。pGlyco2.0能夠充分利用階梯能量HCD糖肽譜圖種的碎片信息，並且在糖鏈、肽段和糖肽三個層面都進行質控，從而獲得高質量的鑒定結果（下圖）。作為對比，目前絕大多數完整糖肽檢索引擎只對糖鏈或者肽段進行單方面的質控。

在此基礎上，研究人員開發了基於重標技術的糖肽數據質控流程（下圖），首次在複雜樣品（酵母）中，客觀地比較了不同檢索引擎彙報糖肽結果的假陽性率：pGlyco2.0的假陽性率不到1%，而目前最常用的商用軟體Byonic，其假陽性率在特定情況下高達20%。該質控流程為完整糖肽分析領域提供了全新的工具和標準，可以作為後續方法發展的評價指標之一。

糖肽數據質控流程示意圖

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最後，研究人員使用pGlyco2.0整套流程，在小鼠五個臟器（心肝腦肺腎）中，鑒定了超過一萬條非冗餘糖肽，是目前最大的完整糖肽數據集。

值得一提的是，該工作是2016年發表在Scientific Reports雜誌上的相關研究的一個較大的延伸（下圖）。2016年該研究團隊就首次報道了一款解析完整 N-糖肽質譜數據的軟體——pGlyco。該軟體利用了質譜採集數據的HCD （High Collsion dissociation）和CID（Collision-induced dissociation ）碎片信息實現了糖肽的鑒定解析，填補了目前完整N-糖肽鑒定方法中缺少false discovery rate (FDR)分析、糖肽鑒定方法中缺少充足碎片信息的空缺，挑戰了糖蛋白組學分析中最困難的方面，解決了目前N-糖肽鑒定中FDR高等問題，達到對蛋白糖基化微異質性的可靠表徵。

據悉，該論文的共同第一作者有五位，分別為復旦大學生物醫學研究院博後劉銘琪，北京中科院計算所助理研究員曾文鋒，復旦大學生物醫學研究院博士方盼，博後曹緯倩，中科院北京計算技術研究所助理研究員劉超。復旦大學生物醫學研究院楊芃原教授，中科院北京計算技術研究所賀思敏研究員，上海蛋白質中心黃超蘭研究員為共同通訊作者。復旦大學生物醫學研究院為第一完成單位。該項目得到國家重點研發計劃，國家重大儀器專項，973和863計劃的支持。

參考文獻：

1. Alley, W. R. Jr. Mann, B. F. & Novotny, M. V. High-sensitivity analytical approaches for the structural characterization of glycoproteins.Chem. Rev.113, 2668–2732 (2013).

2. Dallas, D. C., Martin, W. F., Hua, S. & German, J. B. Automated glycopeptide analysis--review of current state and future directions.Brief. Bioinform.14, 361–374 (2013).

3. Desaire, H. Glycopeptide analysis, recent developments and applications.Mol. Cell. Proteomics12, 893–901 (2013).

4. Hu, H., Khatri, K. & Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis.Mass. Spectrom. Rev.36, 475–498 (2016).

5. Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass. Spectrom. Rev.31, 666–682 (2012).

6. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R. & Khoo, K. H. Novel LC-MS(2) product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides.Anal. Chem. 86, 5478–5486 (2014).

楊芃原教授簡介

楊芃原教授，現任復旦大學化學系特聘教授，生物醫學研究院常務副院長。曾任中國人類蛋白質組學學會理事長，質譜學會常務理事，國家蛋白質重大科學研究計劃專家組成員，兩次擔任國家重點基礎研究計劃（973計劃）首席科學家，除此之外還主持了多項國家自然科學基金委重大重點項目與上海市創新團隊項目。曾獲教育部自然科學一等獎、二等獎、福建省科技進步一等獎，教育部科技進步二等獎等多個獎項。以通訊作者發表SCI論文兩百餘篇。主要研究方向為生物質譜儀器開發與應用。

賀思敏研究員簡介

賀思敏，現任中科院北京計算技術研究所研究員。1986年－1991年本科畢業於清華大學計算機科學與技術專業；1991年－1997年繼續在清華大學計算機科學與技術專業獲得博士學位；1997年－2002年，國家智能計算機研究中心-摩托羅拉聯合實驗室，北京算通科技發展有限公司；2002年7月－ 中國科學院計算技術研究所。主要研究方向為：應用演算法學、生物信息學、信息檢索。與生物醫學相關的主要成果是主持研製我國第一套規模化蛋白質序列鑒定軟體系統pFind。近年來的研究工作主要發表在Nature Method、Nature Communications、Bioinformatics、Journal of Proteome Research、 Scientific Reports等雜誌上。

黃超蘭研究員簡介

黃超蘭，現任中科院上海生化與細胞研究所上海（國家）蛋白質中心研究員。1994年香港中文大學取得學士學位後，於1996年進入香港大學研究院（化學系）獲理學碩士（1998）和博士學位（2002）。博士論文專門研究基本原理質譜 (Fundamental mass spectrometry) 中的氨基酸和多肽的氣相裂解機理 (gas phase fragmentation mechanism of amino acid and peptide) 。2003-2005 在香港大學化學系支志明教授組從事研究助理，協助港大生物醫藥開發中心（BDC，HKU）和香港特區衛生部（Department of Health, HKSAR）建立新的標準化分析實驗室，制定政府中藥藥典。於2005 年4月以訪問科學家身份到John Yates 教授 （The Scripps Research Institute, TSRI）實驗室，2006 年成為John的博士後研究員，2008 年被聘為Staff Scientist, 2010 年晉陞為Senior Staff Scientist，並同時為國家中心研究資源(NIH)的酵母資源中心（Yeast Resource Center, YRC）和Scripps生理蛋白質組學研究中心（Center for Physiological Proteomics, CPP）的Lead Scientist。2013年1月起，任中科院上海生科院生化與細胞所研究員、國家蛋白科學中心質譜系統主管。2014年入選中科院引進傑出技術人才

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