苯系物檢測完整手冊（下）：色譜條件及樣品處理

3 苯系物檢測的色譜條件

3.1 概述

色譜條件涵蓋的範圍較廣，色譜分析過程中一切影響因素都可以包含在內，但主要因素還是在進樣口、色譜柱、檢測器三個方面：

3.1.1進樣口

首先要確定進樣種類，例如分流或不分流或瞬間不分流等。一般小口徑毛細管柱用分流進樣，填充柱用不分流進樣，大口徑毛細管柱用分流進樣或者不分流進樣都可以，但從重現性和靈敏度方面考慮，建議選擇不分流進樣模式。苯系物的沸點較低，難以實現柱頭聚焦，因此瞬間不分流模式難以應用。若使用分流模式，要選擇合適的分流比，分流比對靈敏度和分離效果都會產生影響，這在後面還會討論。

其次是進樣口溫度，苯系物易揮發，進樣口溫度在100~150℃左右已經完全能夠使樣品瞬間氣化，沒必要使用更高的氣化溫度，設置溫度太高反而對重現性不利。

進樣量對於目前使用的儀器來說通常是1μL液體樣，或者幾十到幾百μL氣體樣。但是早期標準會使用比較大的進樣量，這是因為早期儀器使用的是較粗的填充柱，內徑達4mm。

柱容量與橫截面積成正比：2mm內徑填充柱一般進樣1μL液體或者500μL氣體，這是目前儀器常見的規格；3mm內徑填充柱的進樣量可達2μL以上的液體或者1~2mL氣體；4mm內徑填充柱的進樣量可達5μL液體或者5mL氣體，但這種規格的儀器和色譜柱現在已經很少生產了。毛細管柱與填充柱無法直接比較，但也有類似規律，所以內徑較小的需要使用較大的分流比。

3.1.2檢測器

FID對於檢測苯系物是最合適的。檢測器溫度設置150~180即可，因為一般比最高柱溫高20℃就能防止冷凝問題，太高反而使樣品分解、噴嘴積碳的危險增加。FID工作中比較重要的參數是氮、氫、空三氣的流量，一般要求接近1:1:10，通常是氮氣30~40mL/min、氫氣35~40mL/min、空氣350~450mL/min。

需要注意的是，這個流量比例的計算中要把載氣包括進去。例如大口徑毛細管柱使用氫氣做載氣，柱流量10mL/min時，作為燃燒氣的氫氣流量需相應的減小10mL/min；再比如2mm內徑填充柱使用氮氣做載氣，柱流量15mL/min時，作為補充氣的氮氣應調整至15~25mL/min，這樣才能獲得最佳的檢測靈敏度。

3.1.3色譜柱

這方面包括色譜柱的選擇，以及柱流量、柱溫三個方面。

首先是選擇合適的色譜柱。固定相型號是色譜柱核心參數，不同型號固定相在分離選擇性上的差異後面還會詳細討論，這裡先總結一些關於柱規格的一般規律。填充柱的規格涉及到色譜柱製備的相關技術，已經超出一般檢測技術的範疇，這裡暫不討論。毛細管柱規格一般包括內徑、膜厚、柱長三個參數，柱長的影響是顯而易見的，而對於內徑和膜厚很多人認識不足或者有誤解。

膜厚是很多人在選擇色譜柱是經常忽略的一個參數，但實際上對保留時間、分離度、峰型等都有重要影響。一般來講，增大膜厚使容量因子增加，其結果不僅僅是保留時間延長，更重要的是可以使弱保留的物質分離效果變好，所以針對低沸點物質應選用液膜較厚的色譜柱，詳細推導可參見各儀器分析教材中關於色譜理論的部分。對於高沸點物質，提高膜厚對分離度沒有明顯的好處，還使分析時間顯著加長，所以一般要選擇較薄的液膜。另外，低沸點物質的峰型也會因為厚液膜的聚焦作用而改善。

對於柱內徑，很多人在認識上存在誤區。

一般認為內徑小的柱效高，所以分離效果更好。但這只是理論上推導的結果，實際應用中既要考慮色譜柱製造的品質，又要注意儀器與色譜柱的匹配。根據理論推導，0.53mm內徑的色譜柱的柱效在1500塔板/m左右，0.32內徑的約為2000~3000塔板/m，0.25mm內徑的可達5000塔板/m。

但是實際生產的產品很難達到完美狀態，實測值通常遠低於理論值，只有少數大廠的產品才有接近理論極限的品質。在一些國產色譜柱的使用中，經常會遇到過0.53mm柱只有不到300塔板/m的情況、0.25mm柱剛剛超過1000塔板/m的情況。即使購買了品質很好的色譜柱，柱效高低還會受柱外效應的制約，如果儀器的性能不足，特別是分流進樣口效果不好時，會使柱效大打折扣。

對於這樣性能不佳的儀器，使用小口徑柱是無法發揮其高柱效的優勢的，同時小口徑柱要求更高的分流比，這類性能不佳的儀器在分流比較高時重現性會顯著降低，靈敏度損失更加顯著。所以，我的建議是，國產中低端色譜應優先選用0.53mm的大口徑毛細管柱，在不分流或者分流比較小的條件下使用；配有自動進樣器和EPC的高端色譜選用0.32mm口徑的毛細管柱；只有在高速、高通量應用，以及與質譜聯用時，才應該考慮0.25mm或更小內徑的毛細管柱。

在色譜柱的型號規格確定之後，柱流量和柱溫的確定是比較簡單的。毛細管柱的流量是由最佳線速度決定的，詳細推導可參閱范迪姆特方程的相關理論教材，其結論就是，使用氮氣作為載氣時線速度15~20cm/s較合適，使用氫氣載氣時線速度40~60cm/s較合適，使用氦氣載氣時線速度30~40cm/s較合適。一般可適當增大流速儀節省分析時間，但線速度太高會使分離度降低。

線速度與流量的測量與換算，目前大部分儀器可以通過EPC完成，也有相關的計算軟體，這裡就不討論了。填充柱的流量也是較為固定的。具體各種柱的流量可參考下表：

柱溫的確定一般參考目標物的沸點及其與固定相的親和力。對於苯系物，柱溫一般在50~120範圍內。使用填充柱一般是60~90℃範圍內的恆溫操作。使用毛細管柱一般是初始50℃保持2~5min，然後以5~10℃/min的速度升溫至全部出峰。後面會給出具體實例。

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3.2 使用PEG毛細管柱的條件

PEG是強極性固定相，通過誘導力作用可以實現二甲苯異構體的分離。使用大口徑、厚液膜、長柱是較為理想的選擇。60m*0.53mm*1.0μm規格的PEG柱，在不分流或者低分流比條件下使用，可以同時獲得好的分離效果和優異的重現性。若換用0.32mm*0.25μm柱，柱效更高、分析速度更快，但必須使用較大的分流比。

實驗證明，分流低於4時峰展寬就已經較為明顯，無法發揮小口徑柱柱效高的優勢。而分流比較大時不僅靈敏度降低，還對重現性不利，即使用自動進樣器，也能明顯的發現99:1分流時重現性比9:1分流時要差一些，而且沸點差異較大的各種組分出現「分流歧視」的現象。

當然，儀器的性能越好這種問題就越不明顯，但目前的技術水平下，這一問題還無法徹底解決。所以我建議，如果不是十分必要，不應該選用太大的分流比。

在溶劑為甲醇時，苯峰處於甲醇峰的拖尾上，若使用大口徑厚液膜柱，分離度基本上可以接受，但使用0.32mm*0.25μm柱時完全無法分離苯和甲醇。所能夠採取的措施只有進一步提高分流比，當分流比達到49:1時，可以實現苯與甲醇的分離，但靈敏度損失嚴重。

從色譜圖上可以看出，苯峰被甲醇覆蓋的原因在於甲醇峰的過載。如果是微量的甲醇，使用小口徑柱會有更好的分離效果，但作為溶劑，甲醇在小口徑柱上的過載更加顯著，導致溶劑峰展寬，從而與苯無法分離。

因此使用大口徑、厚液膜的色譜柱，對於處理溶劑峰更有優勢。

3.3 使用弱極性毛細管柱的條件

使用聚甲基硅氧烷SE-30、6%氰丙基苯基-94%甲基-聚硅氧烷DB-624、14%氰丙基苯基-86%甲基-聚硅氧烷OV-1701等弱極性毛細管柱也能檢測苯系物，但對、間二甲苯無法分離。

需要注意的是鄰二甲苯與苯乙烯的出峰順序。這兩種物質與固定相之間的作用力，除了色散力以外，還有誘導力，而且苯乙烯更加容易被極化，所以隨著固定相極性的增強，苯乙烯保留時間增加更多。

在完全非極性的SE-30固定相上只考慮色散力、不考慮誘導力，苯乙烯保留時間小於鄰二甲苯。在極性較強的OV-1701固定相上，苯乙烯的誘導力作用顯著比鄰二甲苯強，而且誘導力起的作用超過了色散力，所以苯乙烯保留時間比鄰二甲苯長。對於極性更強的固定相，苯乙烯出峰比鄰二甲苯延遲更多。

對於DB-624固定相，其極性介於SE-30與OV-1701之間，苯乙烯的色散力比鄰二甲苯弱、但誘導力比鄰二甲苯強，而且二者正好處於平衡，所以兩者幾乎同時出峰，難以分離。

這一現象是由分之間作用力決定的，因此改變色譜條件難以改善二者的分離效果。因此涉及到鄰二甲苯與苯乙烯分離的問題是，切勿使用6%氰丙基苯基-94%甲基-聚硅氧烷固定相，選擇極性較強的固定相更為有效。

使用弱極性毛細管柱的優勢在於溶劑峰分離較好，不論是二硫化碳溶劑還是甲醇溶劑，都不會干擾苯峰。

3.3 使用有機皂土填充柱的條件

有機皂土是蒙脫土的季銨鹽，他是一種對取代芳烴的位置異構體有特殊選擇性的固定相，特別是在分離對二甲苯和間二甲苯方面效果突出。將有機皂土與鄰苯二甲酸二任酯（DNP）混合使用，可以製得用於苯系物檢測的專用填充柱，這是國內外廣泛採用的經典分離方法，國外的部分現行標準也在使用。

用於8種苯系物（包括異丙苯）分離時，應該使有機皂土的負載量低於DNP的負載量，並且需要在較低柱溫（60~70℃）下操作（圖8）。如果不考慮異丙苯，可以使機皂土的負載量高於DNP的負載量，並在較高柱溫下操作（80~100℃），這樣可以使對、間二甲苯分離度更高，並且使分析時間縮短（圖9）。但應注意的是，此條件下鄰二甲苯與異丙苯無法分離。

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3.4 使用其他填充柱的條件

其他的常規填充柱一般都無法實現苯系物的有效分離，但現行標準方法中仍然保留了一些針對部分或單一苯系物進行測定的方法，主要涉及到PEG固定相和聚甲基硅氧烷固定相（SE-30或OV-101等）。

PEG固定相極性很強，是除有機皂土外對二甲苯異構體選擇性最好的固定相，但是在柱效不夠高的時候仍然無法實現異構體的有效分離。要想嘗試PEG填充柱分離二甲苯異構體，必須使用9m以上的長柱，理論塔板數需要接近1.5萬，單次的分離時間幾乎需要1小時。這種情況顯然是沒有實用意義的。

對於PEG固定相，還需要說明的是，目前常用的是分子量2萬的PEG，其最低使用溫度一般不能低於60℃。在更低的溫度下，PEG有結晶的趨勢，其結果是使傳質阻力顯著加大，保留變弱、峰變寬。所以長期未使用的PEG柱在使用前最好先100℃以上活化，然後降溫到使用溫度。經過高溫活化的PEG柱在50℃可以短期使用，不會馬上出現結晶的問題，但進過較長時間後就可能會觀測到柱效降低的現象。在60℃使用則是比較保險的。PEG固定相的毛細管柱也有類似問題，但經過廠家的改進，一般結晶溫度已經明顯降低。

非極性的聚甲基硅氧烷固定相對苯系物選擇性較差。SE-30填充柱分離苯系物效果不好，而且不能應對甲醇的溶劑峰拖尾。

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4 苯系物檢測的樣品處理

樣品處理方法和步驟在各個標準中有詳細描述，前面的表中也已經做了歸納總結，這裡再簡要強調一下相關的注意事項。

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4.1 環境空氣樣品

一般用固體吸附劑裝填吸附管進行採樣，常見吸附劑有TENAX和活性炭。TENAX脫附較為容易但是穿透體積較小，特別是苯容易出現穿透。活性炭傳統體積大，一般不用擔心穿透的問題，但是必須較高溫度下通氣較長時間才能完全脫附。所以一般TENAX採樣後採取熱脫附直接進樣，而活性炭採樣後採取二硫化碳溶劑解吸然後進樣。活性炭採樣然後熱解吸直接進樣的方法一般只單獨針對苯的測定（GB 50325-2010），而「GBZ/T 160.42-2007」中高溫通氣100mL的解吸方法則不易操作。

空氣中粉塵較多時，採樣管前應增加過濾裝置。空氣濕度大時對採樣效果有不利影響，容易引起提前穿透，目前文獻中報道有多種除濕方法，但有效性還無定論，各標準方法中均為採用，所以針對濕度大的氣樣，一般是減小採樣流速和時間。

用二硫化碳溶劑解吸法要注意二硫化碳的純度，每次買的試劑都必須進行空白值的檢驗，如果空白值不合格，就必須更換試劑或者提純。

4.2 環境水樣

一般採樣頂空或液液萃取。目前全自動頂空儀的使用已經較為普遍，操作已經大為簡化且自動化程度較高，缺點是平衡時間長，分析速度較慢。頂空法的使用中一般要注意空白值和儀器管路的殘留。室內空氣污染和實驗用水質量不佳經常是空白值偏高的原因。試樣添加的無機鹽必須高溫灼燒。

採用液液萃取萃取法操作較為繁瑣，而且要注意萃取過程中的揮發損失問題，因此操作溫度不能太高，而且最好能保證實驗室恆溫。萃取過程中振蕩不易太劇烈，以免乳化。一般振蕩3min基本上可以達到萃取平衡，時間太長反而使揮發損失問題更加嚴重。

二硫化碳萃取水中苯系物的萃取率一般可以達到90%以上，但揮發損失卻不易確定，特別是二硫化碳自身的揮發損失較大，所以一般仍然需要將標樣按樣品同樣的條件進行萃取然後測定，從而建立校正曲線。

使用二硫化碳萃取法時，另外需要強調兩點：一是二硫化碳的純度問題，這與空氣樣品的要求是一樣的；二是對於污水試樣，萃取液必須經過混合酸凈化，否則干擾問題難以解決。

近年來報道了採用分散液相微萃取技術改進的二硫化碳萃取法，有毒試劑的用量顯著減少，速度也明顯提高，在實際應用中可以參考。

4.3 土壤樣品

土壤樣品中苯系物的穩定性更差，採樣時要更加註意，儘可能直接採集到測定時使用的容器中（頂空瓶或吹掃管）。頂空法的注意事項與水樣基本相同。

4.4 其他工業產品

如建材、塗料等，種類繁多，難以一一詳細討論，但總的來說主要有兩類方法：

一是頂空處理，加適當溶劑、或者直接頂空平衡，然後測定，可參照頂空法；

二是用適當溶劑溶解後直接進樣測定，操作簡單，但是要注意是否有基體干擾問題，而且溶劑選擇要合適，不能干擾目標物，還要注意試樣與標樣的溶劑一致。

5 結語

苯系物的檢測涉及的技術幾乎覆蓋色譜分析技術的大半領域，涵蓋的知識面很廣。本文就筆者所了解的方面進行了一些總結與討論，難以面面俱到，疏漏不足在所難免，但求能夠有少許參考價值。

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雨木霖、wazcq兩位版主對文中不足提出建議，在此表示感謝。

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