連環炮！Circulation雜誌再發重要circRNA文章

8月31日，著名循環學雜誌Circulation在線發表了復旦大學眼耳鼻喉科醫院顏標教授與趙晨教授為共同通訊作者的文章，介紹發現circular HIPK3在糖尿病視網膜血管障礙中的作用[1]。

circHIPK3大家一定非常眼熟，目前已有多篇研究論文介紹發現了該circRNA的重要功能，包括前不久發表在EMBO Reports雜誌的文章，還有復旦大學腫瘤研究所黃勝林教授2016年發表在Nature Communication雜誌的文章等等。經過整理，目前可以檢索到的關於circHIPK3的文章及主要信息概括如下：

表1 關於circHIPK3的研究論文匯總

有個非常重要的問題，HIPK3基因可能會形成很多種的circRNA分子，這些文章中所描述的circHIPK3是同一個分子嗎？本文中作者也提到了circBase資料庫中人類HIPK3基因來源的circRNA有20種，小鼠有3種。山人從CIRCpedia資料庫中檢索，來自人類HIPK3的記錄達99條對應於14種circRNA分子，小鼠也有35條記錄對應於8種circRNA分子。那麼這些文章里探討的circRNA分子是否是同一個分子呢？山人將它們的circRNA分子信息匯總至上表的概要信息中。來自HIPK3第二外顯子單獨環化的circRNA（hsa_circ_0000284）是目前主要討論的，文獻中提到的circHIPK3均為該分子，它的丰度很高，且與小鼠中對應的circRNA序列同源性較高，這也是該分子受到廣泛關注的關鍵。

本文中探討的circHIPK3也是hsa_circ_0000284，對應於小鼠中的mmu_circ_0001052，兩者同源性較高。本文發現circHIPK3可以競爭性結合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p，這些miRNA分子沒有出現在之前的報道中，屬於新發現的circHIPK3競爭性結合miRNA分子。主要的研究思路包括以下幾部分：

（1）circHIPK3的穩定性特徵與轉錄機制分析；

（2）功能缺失/獲得模型研究；

（3）預測可結合的miRNA分子，並通過實驗驗證，進一步分析相關miRNA分子下游基因網路，找出可能與本文故事有關的通路和分子；

（4）體外/體內驗證所得到的通路模型，臨床標本檢測。

總體而言，本文的邏輯思路和機制研究難度不是特別大，最主要的意義是揭示了circHIPK3分子在糖尿病視網膜血管障礙中的作用機制，並進一步發現circHIPK3分子可以影響血管生成作用，對於疾病治療和診斷有重要價值。

1. circHIPK3的穩定性特徵與轉錄機制分析

經過保守性分析及表達量分析後，作者選擇人中的hsa_circ_0000284和小鼠中的mmu_circ_0001052分別作為circHIPK3分子進行下一步研究。首先從小鼠的各種臟器組織和人的多種內皮細胞系中分析circHIPK3的表達情況。然後也做了Sanger測序驗證了junction point上下游的序列。

圖1 circHIPK3序列鑒定與表達特徵分析 （來自[1]）

作者還在HRVECs細胞中分析了circHIPK3穩定性的問題，主要是通過真核轉錄抑製劑放線菌素D抑制轉錄，然後分析隨著時間推移，相關RNA丰度的變化情況。結果表明circHIPK3的半衰期大於34小時，而線性HIPK3分子半衰期還不到5小時。

圖2 circHIPK3穩定性分析（來自[1]）

進一步的研究表明circHIPK3分子主要存在於胞質中（作為micro RNA Sponge功能模型的重要特徵）。作者還初步分析了circHIPK3表達量與糖尿病模型的關係，小鼠糖尿病模型中表明高唐處理後，circHIPK3的表達隨著時間延長而迅速增加。此外，一些糖尿病伴隨癥狀也與circHIPK3表達升高有關，如氧化應激，炎性作用等等。

圖3 circHIPK3在糖尿病模型中高糖刺激後表達顯著升高（來自[1]）

作者藉助TRANSFAC工具分析了可能影響circHIPK3轉錄的轉錄因子，發現糖尿病相關的轉錄因子c-Myb有可能介導circHIPK3的轉錄。於是進一步通過干擾c-Myb，ChIP-PCR及構建熒光素酶報告系統等實驗技術證明了c-Myb與circHIPK3的轉錄相關。

圖4 c-Myb介導circHIPK3的轉錄（來自[1]）

2. circHIPK3敲低或過表達的效應

為探索circHIPK3與糖尿病視網膜血管障礙的關係，作者分別進行circHIPK3的敲低或過表達實驗分析circHIPK3在視網膜內皮細胞中的效應。MTT實驗表明干擾circHIPK3後細胞增殖減慢，EdU摻入實驗也證明了這一點。Transwell實驗表明干擾circHIPK3後細胞遷移率下降，管形成（tube formation）能力也下降。過表達circHIPK3後細胞增殖和遷移等指標均增強。

圖5 敲低/過表達circHIPK3的細胞效應分析 （來自[1]）

3. miRNA互作網路分析

miRNA Sponge是目前報道最多的circRNA功能模型，作者也分別通過Ago蛋白RIP實驗，熒光素酶報告基因實驗以及生物信息學預測加驗證實驗，還有FISH實驗進行共定位分析。最終得出結論：circHIPK3可以通過競爭性結合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p發揮miRNA Sponge作用，其中對miR-30a-3p的作用最強。接著，利用TargetScan工具預測分析了miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p的作用下游分子。發現VEGFC、FZD4和WNT2三個候選靶標分子。進一步通過構建這些基因3』UTR區的熒光素酶報告基因，證明了它們的相互作用通路。至此，形成了一個circHIPK3-miR-30a-3p-VEGFC/WNT2/FZD4軸的信號通路。

圖6 circHIPK3競爭性結合miR-30a-3p （來自[1]）

4. circHIPK3相關通路的體體外體內分析

HRVEC細胞中表達miR-30a-3p的模擬物分子能顯著影響circHIPK3導致的細胞增殖，遷移和管形成相關的表型，與直接干擾circHIPK3的表型一致。添加VEGFC或過表達WNT2/FZD4均能部分恢復直接干擾circHIPK3的表型。

圖7 circHIPK3相關通路的體外實驗（來自[1]）

通過體內注射circHIPK3的感干擾RNA，作者證明circHIPK3參與了糖尿病相關視網膜血管功能障礙的過程。

圖8 體內干擾circHIPK3實驗（來自[1]）

對於所得到的完整通路的體內分析，作者主要分析了miR-30a-3p的拮抗劑對糖尿病表型的影響。注射miR-30a-3p的拮抗劑後VEGFC、 FZD4和WNT2的表達升高。生物素標記的miR-30a-3p進行RNA Pull-down實驗也表明miR-30a-3p可以結合到circHIPK3和VEGFC、 FZD4和WNT2的mRNA分子。干擾circHIPK3後可明顯釋放所競爭性結合的miR-30a-3p分子，注射miR-30a-3p拮抗劑RNA則可抑制干擾circHIPK3所帶來的變化。

圖9 circHIPK3相關通路的體內實驗（來自[1]）

在臨床標本中，作者分析了circHIPK3表達量與糖尿病相關癥狀的關係。與非糖尿病的特發性視網膜病變對照相比，糖尿病引起視網膜血管功能障礙組的纖維血管膜中circHIPK3顯著升高。糖尿病患者胞質中circHIPK3表達量顯著升高。表明糖尿病的視網膜和視網膜內皮細胞circHIPK3的表達顯著升高。

圖11 臨床標本檢測circHIPK3 （來自[1]）

本文系統分析了circHIPK3在糖尿病視網膜血管功能障礙中的作用，發現了circHIPK3通過競爭性結合miR-30a-3p進而影響下游基因VEGFC/WNT2/FZD4，豐富了對糖尿病視網膜血管功能障礙疾病機制的認識，也提出了有價值的疾病診斷和治療備選方案。

參考文獻：

1. Shan, K., et al., Circular Non-Coding RNA HIPK3 Mediates Retinal Vascular Dysfunction in Diabetes Mellitus. Circulation, 2017.

2. Zheng, Q., et al., Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun, 2016. 7: p. 11215.

3. Li, Y., et al., CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO Rep, 2017.

4. Liang, D. and J.E. Wilusz, Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes Dev, 2014. 28(20): p. 2233-47.

5. Starke, S., et al., Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Rep, 2015. 10(1): p. 103-11.

6. Jeck, W.R., et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA, 2013. 19(2): p. 141-57.

7. 朱學軍, 田.王.肖., 環狀RNA CircHIPK3通過miR-379調控IGF1表達促進非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299與NCI-H2170的細胞增殖. 中國肺癌雜誌, 2017.

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！