610早報：利用流式分選輔助的ATAC測序發現斑馬魚血管發育特異性增強子

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Robust identificationof developmentally active endothelial enhancers in zebrafishusing FANS-assisted ATAC-Seq

發表狀況：Cell Rep. 2017 July 18

研究團隊：

Department of Molecular, Cell, and CancerBiology, University of Massachusetts Medical School；通訊作者：NathanD. Lawson

小編有話說：

這項研究是一個利用ATAC-seq（一種轉座酶親和性的染色質高通量測序）技術更新已有生物學知識的精巧模板性研究。作者們利用流式分選技術，從具有內皮標誌物熒光報告的斑馬魚胚胎中，分選出內皮細胞（GFP+）和非內皮細胞（GFP-）的細胞核，並進行ATAC測序和後續驗證實驗，找到了9個前人未發現的，特異性調控血管發育的增強子元件。

研究背景：

斑馬魚具有通體透明、發育周期短等優點，是研究血管發育的經典模式生物。而發現斑馬魚基因組中特異性調控血管發育的功能性元件一直具有挑戰性。Chip-seq可以表徵斑馬魚基因組上組蛋白修飾的位點，發現可能的啟動子和增強子。然而Chip-seq只能針對單一的組蛋白修飾位點，且對細胞數量要求較高。ATAC-seq利用了連接有測序adapter的轉座酶（Tn5）結合於基因組中開放的染色質部位，對染色質中的活躍部位進行擴增和高通量測序。相較之前的DNase-seq，ATAC-seq對技術工藝和細胞數量的要求更低。該文的作者很好地結合了其他技術，利用流式熒光分選，分離內皮細胞和非內皮細胞的細胞核，減少了線粒體基因組的干擾，並且可以比對找出內皮細胞特異性的增強子。

研究方法：

1）研究者利用流式分選得到Tg(fli1a:egfp)y1轉基因斑馬魚胚胎中的內皮細胞（GFP+）和非內皮細胞（GFP-）的細胞核，並進行ATAC-seq。

2）作者分別將內皮細胞和非內皮細胞的ATAC-seq數據和已知的轉錄起始位點，已有的Chip-seq資料庫，已知的內皮增強子進行比對。

3）作者分別將內皮細胞和非內皮細胞的ATAC-seq數據和兩種細胞的RNA-seq數據進行整合。

4）對找到的潛在內皮特異性增強子進行功能驗證。將連接有報告蛋白、增強子、啟動子的質粒導入胚胎，觀測是否可以啟動內皮/血管報告蛋白的表達。

研究結果：

1）流式分選細胞核，再進行ATAC-seq，使數據具有更少的線粒體基因組干擾。

2）通過對已知內皮增強子的比對，作者驗證了流式分選輔助ATAC-seq的有效性和準確性。

3）通過內皮特異性ATAC-seq和RNA-seq數據的比對，能夠在GFP+細胞高表達的基因的轉錄起始位點找到ATAC-seq元件的富集（染色質開放區域），從表觀層面上解釋了內皮特異性基因在內皮細胞中的特異性高表達。

4）作者選擇了12個之前Chip-seq資料庫中未發現，但通過ATAC-seq發現的內皮特異性增強子，對其進行功能性驗證。其中有9個能夠調控內皮特異性基因的表達。

研究結論：

利用流式分選輔助的ATAC-seq，對比已知的知識和RNA-seq數據，能夠有效揭示新的血管發育機制，找到新的內皮特異性增強子，且這些發現大部分可以被生物學實驗驗證。ATAC-seq是一種從表觀層面重新理解生物學事件的強大技術。

ATAC-seq的工作原理（NATUREMETHODS, 2013）

研究示意圖

英文摘要：

Identification of tissue-specific anddevelopmentally active enhancers provides insights into mechanisms that controlgene expression during embryogenesis. However, robust detection of theseregulatory elements remains challenging, especially in vertebrate genomes.Here, we apply fluorescent activated nuclei sorting (FANS) followed by Assayfor Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing (ATAC-Seq)to identify developmentally active endothelial enhancers in the zebrafishgenome. ATAC-Seq of nuclei from Tg(fli1a:egfp)y1transgenic embryosrevealed expected patterns of nucleosomal positioning at transcriptional startsites throughout the genome and association with active histone modifications.Comparison of ATAC-Seq from GFP-positive and -negative nuclei identified morethan 5,000 open elements specific to endothelial cells. These elements flankedgenes functionally important for vascular development and that displayedendothelial-specific gene expression. Importantly, a majority of testedelements drove endothelial gene expression in zebrafish embryos. Thus,FANS-assisted ATAC-Seq using transgenic zebrafish embryos provides a robustapproach for genome-wide identification of active tissue-specific enhancerelements.

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