編輯「生命天書」的魔剪——CRISPR/Cas技術

編輯「生命天書」的魔剪

文/陳咨余

CRISPR/Cas技術

從孟德爾的豌豆實驗催生了遺傳學的兩大定律，到摩爾根的果蠅雜交實驗揭示了基因是組成染色體的遺傳單位，再到沃森和克里克發現DNA的雙螺旋結構,近200年來，人類不僅逐漸認識到遺傳因子「基因」的存在以及其控制生物性狀的作用，更在努力解答腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的排列組合是如何決定人與人、人與其他物種之間的不同。三個基本的問題縈繞在每個生物學家的腦海里：每個基因是做什麼的?我們如何找到致病的基因突變?我們該如何處理這些突變的基因？

對基因進行編輯

1990年至2003年，美、英、法、德、日、中六國科學家共同實施了「人類基因組計劃」，推動了基因測序技術發展。這是基因革命的第一個浪潮，人類自此掌握了閱讀「生命天書」的能力。而讓人們真正擁有了編寫「生命天書」的能力的是基因革命的第二個浪潮——「基因組編輯」。

所謂基因編輯技術，是指對DNA核苷酸序列進行刪除和插入等操作。換句話說，基因編輯技術使得我們可以依靠自己的意願改寫DNA，從而改變生物性狀。早在20世紀90年代，第一代基因編輯技術就出現了。然而，利用TALENs （轉錄激活樣效應核酸酶）與ZFN（鋅指結構域核酸酶）這兩種基因編輯技術做基因敲除，不僅在技術上難操作，在經濟、時間、精力的花費都非常大。高門檻、低準確性等缺點一直困擾著研究基因工程的學者。因此，能夠方便而精確地對DNA和核苷酸序列進行編輯，是科研工作者們長期以來的夢想。

伴隨著CRISPR/Cas技術的誕生和成熟，基因的修剪改造變得「平民化」。成本低、易上手、效率高等優勢讓這項技術有了一個新的名字「編輯生命天書的一把魔剪」。這項不僅如風暴般席捲全球，在科研領域掀起巨大波瀾，而且被譽為「本世紀最具創新力的創新技術」具體是怎麼運作的呢？

從細菌免疫系統到DNA編輯工具

CRISPR/Cas 系統由兩大部分組成：CRISPR序列和Cas基因。CRISPR序列全稱「成簇的規律間隔的短迴文重複序列」。這個序列由眾多短而保守的重複序列區和間隔區組成。在這段序列的上游有一個多態性的家族基因，由該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（CRISPR associated），簡稱Cas。 CRISPR/Cas系統在被廣泛運用在基因編輯中以前其實是普通細菌識別並降解來自噬菌體的DNA，從而阻止噬菌體的感染和複製，防禦噬菌體入侵的一種機制。同時，它也為細菌提供了獲得性免疫，來抵抗噬菌體或者外源質粒的再次入侵。

當噬菌體首次入侵宿主細菌時，它的DNA雙鏈被注入細胞內部。每一條入侵者的DNA上都有一段原間隔序列，並且在它的旁邊有一段特定序列（原間隔序列臨近基序PAM ）像名字一樣能夠輕而易舉地識別這段原間隔序列。這個識別任務由細菌DNA中CRISPR序列上游的Cas序列轉錄出的Cas蛋白進行。Cas蛋白在其他酶的協助下能夠把這段原間隔序列剪切下來，並插入細菌DNA中臨近CRISPR序列前導區的下游。細菌DNA會進行修復，將打開的雙鏈缺口閉合，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。不同的入侵者存在不同的原間隔序列，這樣一來細菌DNA的CRISPR序列中就會存在不同的間隔序列。

那當噬菌體DNA再一次入侵細菌的時候又會發生什麼呢？在第一次入侵的時候，各個入侵者的基本信息（間隔序列）都已經被記錄在了細菌的黑名單（CRISPR序列）中。當任意一個入侵者再次到來時，CRISPR序列會在「指揮官」（前導區）的調控下轉錄出大型RNA分子 (pre-crRNA)，CRISPR序列中的重複序列區會轉錄出發卡結構的RNA（tracrRNA)來活化Cas蛋白。在Cas蛋白與核糖核酸酶（RNaseIII ）的幫助下，一整串有著各個入侵者信息的pre-crRNA被剪切出一段段針對不同入侵者的crRNA。這樣一來，它們能像定嚮導彈直接擊向相對應的入侵者的DNA，並把它切斷，從而幹掉入侵者。

自然界細菌利用CRISPR/Cas系統進行免疫反應

雖然在20世紀末科學家就已經意識到了原核細菌中的CRISPR序列，但是直到21世紀初，微生物這一特殊的免疫系統才被科學家加以利用，成為生物醫學史上第一種可高效、精確、程序化地修改細胞基因組，包括人類基因組的工具。

自然界中CRISPR/Cas系統極為多樣，目前在DNA編輯中被廣為運用的是由最簡單的type II CRISPR改造而來的CRISPR/Cas 9系統。科學家將編碼有核酸內切酶活性的Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同製造成為一個單一的載體。同時還加入了入核信號元件讓這些組分可以進入真核細胞的細胞核。這樣一來，只要科研人員針對需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列，插入這個載體的特定部位。在轉入宿主細胞後，這段基因產生的人工構建的嚮導RNA（gRNA）就像細菌內的tracrRNA 和crRNA 的複合體，能指導Cas9蛋白切割宿主細胞特定的DNA序列，從而起到基因編輯的作用。更通俗點來講，傳遞基因組信息的「嚮導」RNA，領著切割 DNA 的「剪刀」剪接酶在茫茫的基因中搜尋，直至發現特定的核苷酸序列，然後將自己貼合上去。一旦剪接酶鎖定了匹配的DNA序列，它就能剪切和粘貼核苷酸，如同word里查找替換功能一樣精確。

CRISPR/Cas 系統的科研歷史

改變人類未來的「魔剪」

近些年來，科學家不斷利用CRISPR/Cas系統取得驚人成就。 那這項日新月異的技術在未來還有哪些振奮人心的前景呢？

從這款大飛機的命名來看，第一個字母「C」是英文「China」的首字母，也是商用飛機英文縮寫COMAC的首字母，第一個「9」的寓意是天長地久，「19」代表的是中國首型大型客機最大載客量為190座。C919大型客機是建設創新型國家的標誌性工程，具有完全自主知識產權，被寄予厚望。

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利用動物為人類提供器官移植源

人類移植器官的短缺一直是器官移植的瓶頸問題，醫學家便把目光轉向了同為哺乳動物的豬類。然而，用豬培育可供移植的器官最大的技術障礙之一在於豬體內存在一些有害基因。這些基因可能給人類帶來新的疾病，並且在移植初期會攻擊人體的免疫系統使之造成排斥反應。中國學者楊璐菡所在的哈佛大學的研究團隊利用CRISPR/Cas 系統敲除了豬基因組中的62個病毒基因，掃清了豬器官用於人體移植的重大難關，為全世界需要器官移植的上百萬病人帶來希望。

利用CRISPR敲除豬體內致病基因使異體器官移植變為可能

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打造基因驅動系統

「基因驅動」最早由倫敦帝國理工學院進化遺傳學家Austin Burt提出，是一個能夠快速將特定性狀擴散到群體中去的系統。2015年11月，加州大學的分子生物學家Anthony James宣布通過利用基於CRISPR/Cas9基礎的基因驅動技術研製出一種攜帶抗瘧疾基因並能將該基因近乎100%的傳給後代的轉基因蚊子，從根源上有效阻止瘧疾的傳播。這意味著，在不久的將來，我們或將能夠根除瘧疾、登革熱等蟲媒疾病，同時消滅或控制入侵物種。

利用CRISPR的基因驅動系統的轉基因蚊子來徹底根絕瘧疾

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根治疑難雜症

基因治療是指通過操作遺傳物質（無論是人類本身的或外源的）來干預疾病的發生、發展和進程，包括替代或糾正人自身基因結構或功能上的錯亂、殺滅病變的細胞或增強機體清除病變細胞的能力等。利用CRISPR/Cas系統指哪打哪的特徵，我們可以破壞特定基因，觀察結果，以此解開基因各司何職的奧秘，找出癌症細胞的阿喀琉斯之踵。並且通過採用CRISPR技術，鎖定諸如HIV、肝炎和人乳頭狀瘤病毒，並摧毀這些頑固的DNA病毒。雖然目前已經在體外實驗上得到證實，但離實際應用還是任重道遠。

基因編輯技術可能開啟一個現在無法想像的全新世界，最典型也是最受質疑的就是關於創造生命或創造人類的問題。2015年底，中美英等多國科學家和倫理學家在華盛頓舉行「人類基因編輯國際峰會」。會後聲明划出的紅線是禁止出於生殖目的而使用基因編輯技術改變人類胚胎或生殖細胞。基因剪刀技術讓科學家們操縱基因的夢想得到實現，它的能力令人極其興奮。這項「本世紀最具創新力的創新技術」，這把編輯生命天書的「魔剪」的未來如何，讓我們拭目以待。

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