DNA甲基化及重亞硫酸鹽測序法在藥用植物中的應用策略
藥用植物的有效成分是其產生療效的物質基礎，研究其成因及影響因素是藥用植物研究的核心內容。黃璐琦等[1]從生物學的角度提出：藥用植物的有效成分是基因型與環境之間相互作用的產物，可用公式表示為表型＝基因型＋環境飾變，這裡的表型指包括有效成分在內的所有藥用植物的特徵，環境飾變是指由生境引起的表型任何不同遺傳的變化。這一基於基因型是決定表型的基礎，環境是條件的假說在丹參Salvia miltiorrhizaBge.[2]、黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi[3]、刺五加Eleutherococcussenticosus(Ruper. et Maxim.) Maxim.[4]等藥用植物的經典遺傳學研究中陸續得到證實，並被普遍認可。但事實上，多細胞生物的每個細胞含有相同的DNA序列，但最終的表型卻不盡相同。藥用植物的研究中也存在相似的問題，如具有單核苷酸多態性的刺五加鯊烯環氧酶（squaleneepoxidase，SE）基因與刺五加總皂苷量呈顯著正相關的AGAACG基因型中，尚存在30%的低量個體[4]。進一步對刺五加SE基因家族的分析結果顯示，各成員在皂苷量和基因型相同個體間的表達情況並不完全相同[5]。這說明單純的經典遺傳學分析無法全面揭示藥用植物有效成分量差異形成的分子機制，DNA序列變異以外的其他遺傳機制可能發揮著重要作用。
隨著遺傳學的發展，人們發現在DNA序列不發生改變的情況下，表達模式也可以發生改變的表觀遺傳學現象。其產生原因包括DNA、組蛋白、染色質水平的表觀遺傳學修飾等，其中DNA甲基化（DNAmethylation）是重要原因之一[6-7]。這為闡明單純基於DNA序列變異等經典遺傳學無法全面揭示的藥用植物品質差異問題提供了新的研究方向。目前對DNA甲基化的研究主要集中於模式生物和農作物，而藥用植物領域的此類報道較少。本文對DNA甲基化的研究成果進行總結，探討相關研究方法在藥用植物中的應用策略，以期為揭示藥用植物有效成分差異形成的分子機制及藥用植物種質資源的評價等提供依據。
1DNA甲基化及其在植物中的特點
DNA甲基化一般是指DNA複製後，在DNA甲基轉移酶的作用下，將S-腺甘醯甲硫氨酸分子上的甲基轉移到DNA分子中胞嘧啶殘基的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶的過程，它是真核細胞生物基因組重要的修飾方式之一[6]。植物中的DNA甲基化以該種形式為主，可佔到基因組DNA中胞嘧啶鹼基的1/3，除此之外，也有少量以N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤的形式存在，但佔比極少[8]。通常核糖體RNA編碼序列、著絲粒和中心體、轉座子序列等異染色質區域的DNA甲基化程度通常較高，而大多數功能基因啟動子區域的DNA甲基化程度較低[9]。
在高等植物中有CG、CHG和CHH（H代表A、C或T）3種甲基化位點，其中主要發生於對稱序列CG和重複序列中[10]，最多可以佔到總胞嘧啶數的50%[11]，而哺乳動物中這一比例則高達60%～90%[12]。另外，動物體中CHG和非對稱的CHH位點的甲基化比例較小，植物體中非對稱位點CHH發生的DNA甲基化頻率較高，但種間差異顯著[13]。不只在動、植物之間，即使在植物內部，DNA甲基化程度也存在較大差異。目前在已經進行基因組DNA甲基化分析的34種植物中，甜菜BetavulgarisLinn.的DNA甲基化水平遠高於任何植物，且具有較高程度的CHH位點甲基化，這與擬南芥中全基因組DNA甲基化程度較低，且CG位點的DNA甲基化在所有物種中最低的特點顯著不同[14]。在重複序列中，CHG和CHH位點的DNA甲基化程度存在很大的種間差異，且經人工栽培的物種（如葡萄、木薯等）往往具有較低的CHH位點DNA甲基化水平[10]。
2DNA甲基化的模式
DNA甲基化包括從頭甲基化和維持甲基化2種模式。從頭甲基化是指在從未發生甲基化的位點上發生甲基化修飾，建立DNA甲基化的過程；而維持甲基化是指維持甲基化的酶可識別新合成的半甲基化雙鏈DNA，並將甲基添加到新鏈的非甲基化胞嘧啶上[15]。
植物中3種位點DNA甲基化的建立均需經過1條通過小RNA的DNA甲基化途徑來實現[16]。該途徑中，RNA依賴的RNA聚合酶2（RNA-dependent RNA polymerase 2，RDR2）首先以長30～40 nt的RNA為模板合成雙鏈RNA，隨後該RNA被切割為長24 nt的小RNA[17]。雙鏈小RNA中的1條鏈與argonaute 4（AGO4）蛋白結合後再與事先轉錄產生的長鏈非編碼RNA通過鹼基配對形成複合體[18]，該複合體進而吸引域重排甲基轉移酶2（domainsrearranged methyltransferase，DRM2）轉移到靶位點，最終完成將S-腺甘醯甲硫氨酸分子上的甲基轉移到靶位點胞嘧啶殘基第5位碳原子上的過程，從而實現DNA的甲基化[19]。這一過程被稱為RNA介導的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）[20]。一旦DNA甲基化建立後，其維持機制因甲基化位點的不同而不同。CG位點發生的甲基化依賴DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1）在甲基化調節因子（variant in methylation，VIM）的輔助下進行維持[21]，CHG位點的DNA甲基化通過植物特異性的染色質甲基轉移酶3（chromomethylase3）和組蛋白H3K9me2修飾的核小體進行特異性互作來維持[22]，CHH位點發生的DNA甲基化僅能在新的細胞周期中重新建立，而不能被維持[23]。
與其他物種相比，植物的3種甲基化位點均具有單獨的DNA甲基化維持途徑，因此，其5-甲基胞嘧啶濃度也相對較高。通常，被子植物中的DNA甲基化位點與轉座子和重複序列相關聯，CG位點的DNA甲基化表現出集中於基因轉錄區域，而CHG和CHH位點的DNA甲基化主要出現於轉座子中，CHH位點的DNA甲基化通常分布於轉座子的末端（圖1）[10]。
3DNA甲基化對藥用植物基因表達的影響
DNA甲基化可影響植物功能基因的表達。植物功能基因啟動子區域的DNA發生甲基化後，可阻止轉錄因子結合到啟動子的甲基化區域，從而抑制基因的表達，成為植物轉錄調控的有效機制之一[24]。具有轉座子的玉米功能基因側翼區域中分布有長100 bp的CHH島，該區域中的CHH位點甲基化率高於25%，抑制基因的轉錄，同時也保護沉默的轉座子免受鄰近基因的活性影響[25]。但基因編碼區的甲基化一般不會影響基因表達[26]。中藥材金銀花的來源植物忍冬LonicerajaponicaThunb.和其自然誘變產生的變種紅白忍冬L.japonicaThunb. var.chinensis(Wats.) Bak.，在合成其主要藥用成分綠原酸過程中的各關鍵酶氨基酸序列完全一致，但基因表達量和綠原酸量在兩者之間差異顯著[27]。特定基因DNA甲基化分析結果表明，紅白忍冬苯丙氨酸裂解酶2（phenylalanineammonia-lyase 2）基因側翼區域的啟動子?109 bp至?279 bp處DNA甲基化程度要高於忍冬，且二者間CG位點的DNA甲基化程度顯著不同，說明DNA甲基化是造成兩者間品質和關鍵酶基因表達差異的重要原因[28]。去甲基化因子5-氮雜胞苷（5-azacytidine）處理石斛組培苗後，其中的多糖和生物鹼量及生物合成關鍵酶基因的表達量均顯著上升，去甲基化後可能激活了上述基因表達[29]。這說明，DNA甲基化和去甲基化修飾對藥用植物功能基因的表達水平均具有重要的調控作用。
4DNA甲基化對藥用植物品質的影響
在植物的生長過程中，DNA甲基化參與調節各種表型特徵的形成及生長發育等幾乎所有生物學過程，如果甲基化水平過低，就會導致植物生長發育及表型異常[30]。HPLC法檢測曼地亞紅豆杉Taxusmediacv. Hicksii全基因組DNA甲基化的結果表明，其DNA總體甲基化水平高低與紫杉醇的量呈顯著的負相關關係[31]。以有性繁殖為主的人蔘基因組DNA中20.81%的位點呈甲基化狀態，不同年齡樣本之間的甲基化狀態差別顯著[32]。相對於野生人蔘，人工栽培措施使得人蔘具有相對較低的胞嘧啶甲基化水平，其中CHG位點的DNA甲基化水平下降最多[33]，說明CHG位點的DNA甲基化對栽培措施和環境條件較為敏感，可迅速改變。另外，CHG位點的胞嘧啶甲基化狀態及人蔘的表型與栽植地點的改變是可逆的，這說明環境誘導的表觀遺傳改變可調節相關基因的表達、影響藥材品質，並且這種改變完全依賴於特定環境的作用[34]。換而言之，低水平的DNA甲基化是造成栽培人參與野生人蔘品質差異的直接原因。
不僅人工栽培和野生條件這種巨大的環境改變可導致藥用植物DNA甲基化水平的改變，單一環境因子也可產生一定的影響。如紅光和遠紅光照射沉香Aquilariaagallocha(Lour.) Roxb後，轉座子和基因間隔區的DNA甲基化狀態變化較小，而啟動子區域CHH位點的DNA甲基化水平顯著改變，CHG位點次之，而CG位點的DNA甲基化水平相對不變。伴隨著DNA甲基化的改變，基因的表達及葫蘆素的量也隨之相應改變，這表明光質可以通過改變CHH和CHG位點的DNA甲基化水平來影響功能基因的表達，進而調控其次生代謝產物葫蘆素的合成[35]。用紫外線照射黃花蒿ArtemisiaannuaL.後，其青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶基因啟動子區域的4個CG、4個CHH和2個CHG位點發生去甲基化，提高該基因的表達量，最終使青蒿素的產量提高1.91倍[36]。楊飛等[37]研究表明，高溫脅迫導致菘藍IsatisindigoticaFort.基因組82個CCGG位點中58個位點發生了甲基化，24個位點發生了去甲基化。對蒲公英TaraxacumofficinaleF. H. Wigg.進行包括食草動物取食、病原體侵染等脅迫處理後，其DNA甲基化程度及位點顯著改變，且其甲基化狀態可傳遞給後代[38]。
體外培養獲得的刺五加胚性愈傷組織的甲基化水平很低，非胚性愈傷組織則呈高度甲基化狀態，沒有再生的能力[39]，輪葉党參CodonopsislanceolataBenth. et Hook.F.組織培養過程中的DNA甲基化狀態顯著改變[40]。這說明利用組織培養獲取藥用植物再生個體或直接生產次生代謝產物的過程中，同樣也伴隨著DNA甲基化狀態的改變。
儘管目前對藥用植物DNA甲基化的研究已有一定進展，但與傳統的模式生物相較而言，整體尚處於初級探索階段。尤其對DNA甲基化調控藥用植物次生代謝過程的作用靶點、作用機制等還缺乏系統深入的研究。
5DNA甲基化分析方法的比較
隨著DNA甲基化研究在模式生物中的深入開展，其配套的研究方法、技術手段已日趨成熟，迄今為止，已有至少25種檢測DNA甲基化的相關技術在動植物中得到應用，根據原理的不同可分為甲基化敏感性位點、親和色譜和重亞硫酸氫鹽轉化三大類[41]。基於甲基化敏感性位點的方法有甲基化敏感擴增多態性（methylationsensitive amplification polymorphism，MSAP）、甲基化敏感PCR（methylation-sensitivePCR，MS-PCR）、差異甲基化雜交（differentialmethylation hybridization，DMH）等；基於親和色譜的方法有質譜、高效液相色譜、熒光毛細管電泳等；基於重亞硫酸氫鹽轉化的方法有甲基化特異性PCR、結合重亞硫酸鹽限制性分析、全基因組重亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感寡核苷酸引物擴增等[42]。但由於多數藥用植物的基礎生物學背景過於薄弱[43]，加之成本高[44]、技術複雜[45]和解析度[46]等原因使基於甲基化敏感位點和親和色譜的方法難於在藥用植物中廣泛應用。而基於重亞硫酸鹽轉化的方法核心是重亞硫酸鹽測序[47]，經其處理後能夠使5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶得以準確區分，即提供了單核苷酸水平的解析度，被稱為是DNA甲基化分析的金標準[48]。因此，其在藥用植物DNA甲基化的定性和半定量分析中具有重要的應用價值[41]。
6重亞硫酸鹽測序法分析藥用植物DNA甲基化的策略
6.1重亞硫酸鹽測序法的基本流程
重亞硫酸鹽測序法分析藥用植物DNA甲基化的基本流程見圖2。將藥用植物的DNA提取後，進行重亞硫酸鹽處理。DNA在高鹽、高溫和低pH值的重亞硫酸鹽處理條件下，未甲基化的胞嘧啶轉變成尿嘧啶。隨後以處理的DNA為模板的PCR擴增中，這些轉化的尿嘧啶鹼基被更換為胸腺嘧啶。而重亞硫酸鹽處理並不影響甲基化的胞嘧啶殘基，因此這些甲基化的胞嘧啶得以維持[47]。進而將擴增產物連接載體、轉化大腸桿菌感受態細胞後，通過測序並與未處理樣本的序列進行比對來鑒定哪些位點發生了DNA甲基化。
6.2重亞硫酸鹽處理的效率
精確鑒定DNA甲基化水平及位點的關鍵是重亞硫酸鹽處理下非甲基化胞嘧啶的完全轉化[41]，但當大量模板DNA經重亞硫酸鹽處理後，並非全部未甲基化的胞嘧啶均能轉變成尿嘧啶，即使在最佳轉化條件下也會有約0.5%不能發生轉化[49]。因此在後期的克隆測序過程中，每個甲基化位點應至少對10個以上的不同克隆樣本進行測序確認，以保證DNA甲基化位點不被遺漏。另外，與靶基因平行的陰性對照也是獲得準確結果的必要條件[50]。
6.3重亞硫酸鹽處理樣本的PCR擴增
植物基因組中的CG量普遍高於動物，經重亞硫酸鹽處理後會使基因組中形成大量的尿嘧啶及重複序列，導致後期PCR擴增所用引物因目標區域少、Tm值低、特異性和穩定性不理想。此時若使用短引物則極容易產生非特異性擴增，因此在實際操作中，採用31～50 bp的長引物，且反向引物的長度及Tm值低於正向引物可大大提高擴增效果[51]。另外，由於待研究物種的基因組或目的基因的DNA甲基化情況未知，導致重亞硫酸鹽處理後模板序列也是未知的，這使得引物的特異性難於保證，因此應通過設計多對引物進行大量摸索實驗加以解決。
為了減少由體外使用DNA聚合酶引起的突變，具有3』5』外切酶活性的高保真DNA聚合酶被廣泛應用於基因的擴增。然而，基因組DNA鏈中的未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶後會阻礙此類DNA聚合酶作用的發揮，甚至完全不能擴增，因此並不適宜用於DNA甲基化的研究[49]。而具有較強擴增高尿嘧啶模板及保真能力不依賴3』5』外切酶活性的DNA聚合酶效果較好[51]。
7展望
生物在適應環境的過程中，基因組和DNA的甲基化常發生相關的變化[52]。從基因組的DNA多態性角度解析藥用植物品質差異及對藥效物質合成調控的研究已有大量報道，但目前對DNA甲基化的認識多數來自於擬南芥和玉米等模式植物和農作物，藥用植物中的相關工作尚處於起步階段。對模式生物的研究表明，DNA甲基化的改變可能比任何基因組的遺傳變化更早和更快地發生[53]，即DNA甲基化的變化具有突變效應[52]。低DNA甲基化可使染色體發生重組，或使DNA中靜止的移動元件活化後發生位移，導致移碼突變等核苷酸變化[54]，而高甲基化則易使C-T或G-A發生轉化，形成點突變[55]，從而產生新的表型以適應環境，並可將其傳遞給下一代[56]。這說明，DNA甲基化除可通過改變關鍵酶基因的表達直接調控藥用植物的次生代謝過程而影響藥材品質外，還可通過間接導致的DNA序列變異而發揮作用。說明DNA甲基化等表觀遺傳對藥用植物品質形成的影響更大。因此，體現藥用植物生物學本質的特化基因型研究，應將經典遺傳與表觀遺傳相結合，科學、客觀地反映各個地區不同的生態或地理條件長期選擇而形成的藥用植物的遺傳本質。
總之，DNA的甲基化為藥用植物研究中經典遺傳學無法全面揭示的問題提供了新的思路，DNA甲基化也在闡明道地藥材形成機制、藥用植物品質差異等領域顯示出廣闊的應用前景。
參考文獻
來 源：邢朝斌，張妍彤，王 卓，宋 菊，龍月紅. DNA甲基化及重亞硫酸鹽測序法在藥用植物中的應用策略 [J]. 中草藥, 2017, 48(24):5063-5069.
TAG:中草藥雜誌社 |