Cas9基因治療再添疑云：人體預先存在對Cas9蛋白的自適應免疫

前言：CRISPR-Cas9系統已被證明是基因組編輯的強大工具，可以精確修飾細胞內特定的DNA序列。目前正在努力使用CRISPR-Cas9系統治療人類遺傳疾病。 但最常用的Cas9蛋白——SaCas9（來自於金黃色葡萄球菌）和SpCas9（來自於釀膿鏈球菌）。這兩種細菌在人群中的感染率很高，那麼人體中是否存在對Cas9蛋白適應性免疫應答就成為了CRISPR-Cas9系統進入臨床試驗時必須考慮的因素。

2018年1月5日，斯坦福大學的研究人員在生物預印網站BioRxiv發表題為：Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans的文章，證實人體預先存在針對Cas9蛋白的免疫應答。

圖1

基因組編輯是一種用於精確改變細胞DNA序列的方法，被廣泛用作研究工具，目前正在開發基因組編輯以創建治療人類疾病的基因療法。來源於CRISPR / Cas9適應性細菌免疫系統的Cas9 / guide RNA（gRNA）平台已經被證明是用於基因組編輯的有力工具，因為它使用相對簡單，目標活性高且特異性高。這一技術正在被用於創造新的細胞療法，通過離體編輯細胞，然後將工程細胞移植到患者體內，或者通過經由病毒載體遞送Cas9 / gRNA體內編輯患者細胞（主要是重組腺相關病毒載體rAAV或納米顆粒）。

例如，使用Cas9 / gRNA系統在體外編輯造血幹細胞來治療鐮狀細胞疾病已經取得了重大進展。類似地，已經使用Cas9 / gRNA系統來編輯體內細胞以解決諸如肌營養不良和色素性視網膜炎的病症。

雖然多種Cas9同源物已經被鑒定，但是最完善的系統來源於金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌。金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）主要用於體內編輯，因為它可以更容易地包裝到AAV載體中。臨床前研究顯示釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）在體外和體內具有巨大的治療潛力。

金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌是常見的人類共生體，也可以是致病性病原體。 在任何時候都有40％的人被金黃色葡萄球菌感染，20％的學齡兒童被釀膿鏈球菌感染。 此外，研究發現，抗金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌的抗體存在於100％的成人中。類似地，人類對這些細菌具有抗原特異性的T細胞的頻率很高。在人類群體中，金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌的豐都，以及對這兩種物種的廣泛適應性體液和細胞免疫反應，都有可能使人類對從這些細菌中獲得的最常用的Cas9同源性免疫。之前的研究中，重組金黃色葡萄球菌在小鼠體內表達，發現其對Cas9有明顯的適應性免疫反應，表明哺乳動物的免疫系統將Cas9蛋白識別為抗原。

人類對Cas9同系物預先存在的適應性免疫應答可能妨礙Cas9 / gRNA系統安全有效地用於治療疾病，甚至可能對患者產生顯著的毒性。在先前的基因治療試驗中，患者對病毒載體已有自適應的免疫反應，但由於抗體的中和作用或細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)對轉導細胞的清除，因此沒有治療效果。同樣，在基因治療試驗中也有罕見的病例，其中患者對所遞送的轉入基因具有預先存在的適應性免疫，導致治療無效和擴增轉入基因產物特異性T細胞無效。適應性免疫應答也可誘導全身炎症反應，導致嚴重的毒性。 當病人死於對基因治療載體的全身性炎症反應時，基因治療領域遭受重大挫折。因此，人類適應性免疫應答可能是體外和體內基因治療的安全性和有效性的巨大障礙，並且不能使用非人類系統可靠地評估。預先存在的適應性免疫應答引起與Cas9 / gRNA系統在臨床試驗中使用的相似的問題。例如，針對Cas9的CTL應答將導致在其MHC分子上呈遞Cas9肽的任何細胞的破壞，潛在地消除編輯的細胞並且使療法無效。

人類對來自SaCas9和SpCas9的細菌的適應性免疫廣泛存在，研究結果表明SaCas9和SpCas9都有預先存在的體液免疫；在一些健康個體中有清楚的SaCas9細胞免疫應答的證據；目前尚未發現SpCas9有預先存在的細胞免疫，但並不能排除這一點。

在健康人體中檢測到Cas9的IgG

首先調查是否有預先存在的Cas9體液反應。為了尋找預先存在的針對SaCas9和SpCas9的IgG抗體，使用來自人臍帶血的血清通過免疫印跡來檢測Cas9。由於IgG穿過胎盤屏障，臍帶血中的IgG含量反映了母親IgG抗體的血清陽性率。發現在人血清中可以檢測到SaCas9和SpCas9的IgG抗體。

圖2--預先存在的Cas9蛋白體液免疫的鑒定

檢測到針對SaCas9的抗原特異性T細胞

體液抗Cas9反應的發現促使我們探索Cas9特異性TH1 CD4 + T細胞和相應的CTLs是否也存在於人體內。為了確定是否存在針對SaCas9和SpCas9的抗原特異性T細胞，我們使用細胞因子捕獲系統。實驗數據表明許多健康人類具有針對SaCas9的預先存在的抗原特異性T細胞，並且這些細胞可以進行擴增並且可以表達效應分子。使用這種細胞因子捕獲系統，未能檢測到針對SpCas9的抗原特異性T細胞。

圖3

基因治療目前應該是人類擺脫遺傳病控制最有前景的治療方法，Cas9系統又是基因治療的有力武器。但是，人類對Cas9同系物預先存在的適應性免疫應答很可能會妨礙Cas9/gRNA系統安全有效地用於治療疾病，甚至可能對患者產生顯著的毒性。現在看來，即使解決了脫靶效應，Cas9用於基因治療之路依然漫長。

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