朱永官等：環境中抗生素與抗性基因組的研究

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絕大部分抗生素原葯及其代謝產物進入土壤後會迅速與土壤發生吸附作用，之後的解吸過程會直接決定其生物有效性。我們研究發現要解決抗生素的污染問題需要特別關注抗生素殘留帶來的微生物的耐藥性——抗生素抗性基因。

文/朱永官1,2*　陳青林1　蘇建強1　喬敏2（1 城市環境與健康重點實驗室中國科學院城市環境研究所 2 城市與區域生態學國家實驗室中國科學院生態環境研究中心）

來源：科學觀察（2017年第6期）

抗生素的發明與使用是人類醫學史上具有里程碑意義的成就。但是，隨著抗生素的大量生產、使用、甚至濫用，抗生素和抗性基因（耐藥性）污染已經成為一個全球性的環境健康問題。抗生素耐藥性是指微生物可以耐受抗生素對其的抑制和致死作用進而存活和繁殖。抗生素和耐藥性的污染是一個問題的兩個方面，即抗生素的殘留會誘導選擇抗性細菌，促進抗性基因的橫向轉移，導致微生物耐藥性的擴散，而攜帶抗性基因的微生物擴散到新的環境會進一步繁殖，並有可能通過基因橫向轉移將抗性基因傳遞給病原菌，給人類健康帶來災難性的危害。目前，除了環境中背景水平的抗性基因外，主要有人類排放（醫院和污水處理廠）、動物養殖和製藥廠等幾個來源。

2011年世界衛生組織（WHO）在世界衛生日的主題是「抗生素耐藥性：今天不採取行動，明天將無葯可用」，其數據顯示，全球每年約有44萬個耐葯結核病(MDR-TB)新發病例，至少造成15萬人死亡。2015年5月WHO發布全球報告，呼籲建立全球抗生素耐藥性監測系統。之後，許多國際組織和機構相應提出了行動方案，阻擊抗生素耐藥性的蔓延，如二十國集團（G20）等。在2016年9月21日聯合國大會第71次會議上，聯合國各成員國採納了抗生素耐藥性高級別會議的政治宣言。這顯示了聯合國各成員國在預防後抗生素時代抗生素耐藥性行動上的共識。為此，聯合國秘書長宣布成立聯合國跨機構耐藥性協調組（IAGA）。為積極應對細菌耐葯帶來的挑戰，提高抗菌藥物科學管理水平，遏制細菌耐葯發展與蔓延，維護人民群眾身體健康，促進經濟社會協調發展，2016年國家衛生計生委等14部門聯合制定了《遏制細菌耐葯國家行動計劃（2016－2020年）》。世界上許多國家生產的抗生素約一半都作為獸葯和飼料添加劑等。動物攝入的抗生素大部分以原葯或代謝產物的形式經動物糞便和尿液進入土壤、水體，從而產生污染，並通過食物鏈對整個生態環境產生毒害，影響植物、土壤微生物和動物的正常生命活動和功能。更嚴重的是，抗生素藥物殘留會造成病原菌的耐藥性增加，從而危害人類健康，增加人類疾病的治療難度。

絕大部分抗生素原葯及其代謝產物進入土壤後會迅速與土壤發生吸附作用，之後的解吸過程會直接決定其生物有效性。我們研究發現要解決抗生素的污染問題需要特別關注抗生素殘留帶來的微生物的耐藥性——抗生素抗性基因。以我國多處大型養殖場周邊土壤作為研究對象，我們採用分子生物學手段開展四環素抗性基因的污染問題研究，發現抗生素的大量使用導致大型養殖場周邊土壤中微生物抗性基因增加，揭示土壤中抗性基因與四環素等抗生素的殘留呈顯著正相關關係。成果發表在Environmental Science & Technology上，美國化學學會的化學和工程新聞專門進行了介紹，認為是「首次來自中國的關於農用抗生素和土壤抗性基因的研究成果，為政府在抗生素使用及產生後果方面的政策制定提供了建議」。

由於抗性基因的多樣性（數百個或更多），傳統的分子生物學技術（普通的定量PCR）無法了解環境中抗生素抗性基因的全貌。在2007年，我們有幸為國際著名微生物生態學家James Tiedje申請了中科院的愛因斯坦講習教授計劃，藉此，Tiedje教授於2008年5月初來訪，與我們開展了深入的學術交流。通過交流，我們商定採用高通量定量PCR技術研究環境抗生素抗性基因。經過進一步改進和優化，我們的高通量定量PCR可同時檢測244種抗性基因。我們對國內三個大型養豬場的豬糞、豬糞生產的堆肥以及施堆肥後的土壤樣品進行抗性基因分析，共檢測到149種抗性基因。這些抗性基因幾乎涵蓋了目前已知的絕大多數抗生素類型，即使一些未在豬場使用的抗生素也檢測到了相應的抗性基因（圖1)。就抗性基因丰度而言，與不使用抗生素的對照豬糞樣品相比，共有63個抗性基因顯著富集，富集倍數中值為192，單個抗性基因的最大富集倍數可達2.8萬倍。豬糞生產的堆肥中也同樣檢測到了多種類型和抗性機制的抗性基因，最高的富集倍數可達5.7萬倍。研究同時還發現抗性基因的丰度與環境中抗生素和砷銅等重金屬濃度均呈顯著正相關，說明砷銅等重金屬和抗生素的複合污染可以增加環境中抗生素抗性基因的富集。該成果在PNAS上發表後得到國際同行和公眾的廣泛關注。Nature專門報道和詳細討論了我們的研究成果。其他許多國際媒體如New York Times, New Scientists 均給予了報道。該論文在Web of Science 中入選高被引論文。

污水和中水回用也是抗性基因傳播的主要途徑。為此，我們同樣採用高通量定量PCR的方法，對中國7個代表性城市的公園土壤樣品中的抗性基因進行分析，在所有的土壤樣品中共檢測到了147種抗性基因。與未使用再生水澆灌的公園對照土壤相比，共有105種抗性基因在再生水澆灌的公園土壤樣品中有顯著性富集，其中抗性基因總的富集倍數最大可達8655.3倍。同時在再生水澆灌的公園土壤樣品中檢測到了4種轉座酶基因，最高圖1　抗性基因的檢出數（A）以及不同種類抗性基因所佔的比例（B）的富集倍數可達2501.3倍。研究發現抗性基因與轉座子酶基因丰度之間具有顯著的正相關關係，表明轉座子可能促進了抗性基因的傳播。本研究揭示了再生水澆灌導致了城市公園土壤中抗性基因的富集。

除了污水和中水，污泥作為污水處理系統的副產物，是環境中抗生素抗性基因的重要存儲庫。而日益發展的城市使得城市污水處理廠每天產生大量的剩餘污泥，截至2015年我國已建污水處理廠已超過3500座，每年產生約3500萬t污泥。堆肥化處理是指在微生物的作用下，將有機廢棄物轉化成腐殖質的過程，產生的堆肥產品可用作土壤改良劑和肥料。在堆肥化過程中抗生素抗性基因是怎樣變化的，微生物和抗性基因之間又有何關係？我們採用高通量熒光定量的方法研究了污泥堆肥處理過程中抗生素抗性基因的特徵變化，並且採用16S rRNA基因高通量測序法研究了堆肥過程中微生物群落結構的變化。結果共發現156種抗生素抗性基因和基因移動元件，並且在堆肥的過程中，抗生素抗性基因的多樣性和丰度都顯著增加。通過微生物群落結構的分析，發現堆肥成熟期放線菌門細菌顯著增加並佔主要地位，由於放線菌是土壤中抗生素的主要生產者，其本身也攜帶多種抗性基因，所以堆肥過程中抗性基因的富集可能是由於放線菌門的變化導致。進一步分析發現微生物群落結構與抗性基因結構顯著相關，證明了堆肥過程中微生物群落結構的組成變化是影響抗生素抗性基因變化的主要原因，這些結果發表在Environmental Science& Technology （Su, et al ., 2015），目前也是Web ofScience 的高被引論文。我們通過污泥長期定位實驗研究了污泥施用對於農田土壤抗性基因的影響，結果表明直接施用污泥或污泥堆肥有可能在土壤中引入新的抗性基因（Chen, et al ., 2016）。該論文在EnvironmentInternational 發表後被歐盟Science for Environment Policy引用並做了詳細報道。最近我們採用該方法系統研究了我國河口濕地中抗生素抗性基因，揭示了抗性基因的分布與人類活動的密切關係，成果於2017年初發表於Nature Microbiology 。

我們在國際合作過程中建立起來的高通量定量PCR技術在環境抗生素抗性基因研究中發揮了重要作用。在此基礎上，我們建立了高通量定量PCR測試研究平台，並且發展了針對生物地球化學循環相關功能基因、環境中病原菌和糞源菌的具有自主知識產權的高通量晶元，為我們開展環境土壤學和環境生物學研究提供了強有力的平台。目前我們的平台也成為國際合作的平台，每年來自美國、英國、澳大利亞、德國和以色列等的科學家和我們開展深度的合作研究。在抗生素抗性基因研究的基礎上，我們闡述了人類活動微生物及其攜帶的基因在環境中遷移的影響，提出了微生物全球尺度的大規模遷徙的模式。該論文於2017年9月15日發表在Science 上。

通過這項研究或這個科學故事，我們認識到：一項創新性的研究需要前沿的科學問題與方法手段的有機結合,同時環境領域的相關研究必須面向現實社會。

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