SOX11促進浸潤性生長和導管原位癌的發展
翻譯：馬東慎 審校：劉慧
介紹：
胚胎乳腺上皮細胞構成獨特的細胞群，這群細胞由未分化的、高度可塑性的祖細胞組成，最終發育為所有其他出生後的乳房上皮細胞譜系。越來越多的證據表明，腫瘤幹細胞或幹細胞樣細胞存在於癌細胞中，並能夠在許多實體瘤治療後維持癌細胞的生長。在皮膚、腸道和大腦中都存在腫瘤幹細胞，它們與負責生長和更新身體組織的健康幹細胞非常相似。譜系追蹤研究表明，胚胎乳腺上皮細胞（MECs）在體內是多能的，但是它們在乳腺癌中的作用還不清楚。腫瘤可能從處在細胞分化不同階段的祖細胞樣細胞中發育而來，而胚胎乳房祖細胞與乳腺癌的潛在聯繫還有待探索。
作者分析了胚胎小鼠乳腺基因標誌，並發現胚胎乳腺細胞和乳腺癌細胞之間有明顯的相似之處。作者發現，胚胎乳腺上皮標誌在小鼠Brca1 - / - 腫瘤和人類基底樣乳腺癌中被激活。一些與祖細胞/幹細胞功能調節相關的胚胎基因組成的小型調控網路，也在癌細胞中激活。該調控網路中的一個基因，SOX11，在正常出生後的乳房中未檢測到，但在基底樣和HER2+乳腺癌中高度表達。已知SOX11能夠促進組織重塑、祖細胞擴增和許多細胞類型（包括神經祖細胞）的分化。SOX11在胚胎幹細胞和胚胎腎細胞中的誘導表達導致調控發育過程（包括器官發生）相關基因的啟動。因此，在浸潤性乳房病變或浸潤性乳腺癌中SOX11的表達可能因此提示這種癌組織含有一類特殊的細胞，該細胞具有與胚胎乳房祖細胞相關的典型特徵，並且生長模式不同於成熟的出生後的乳房細胞。
導管原位癌（DCIS）呈現出這樣的臨床問題：它可能存在潛在的過度治療或治療不足的風險，且缺少生物標誌物來識別那些可能繼續惡化而需要更積極治療的DCIS病變。已經發現SOX11在包括DCIS在內的浸潤前期損傷中高度表達。在與乳腺癌相關的非典型性導管增生（ADH）而不是與癌症無關的ADH中檢測到了較高水平的SOX11。因此，SOX11可能是介導DCIS進展的重要因素。在此，作者分析了成熟乳房細胞MCF10A和導管原位癌細胞DCIS.com（來自MCF10A進展系）中上調SOX11表達的作用。
結果：
SOX11水平對出生後乳腺祖細胞譜的影響
作為胚胎期乳腺細胞的標誌，作者確認它不表達在成熟的乳腺組織中（圖1A）。而在三陰性（ER、PR、HER2均為陰性）和HER2+乳腺癌細胞系中能夠檢測到SOX11的表達（圖1B）。在DCIS.com或MCF10A細胞中作者沒有檢測到SOX11的表達——這兩種ER-細胞系常被分別用來研究DCIS和正常出生後MEC細胞的生長（圖1B）。為了研究SOX11在正常MEC細胞中的表達所產生的效應，作者將SOX11穩轉到MCF10A細胞中（圖1C），並且能夠在細胞核中發現過表達的SOX11（圖1D）。CD49f和EpCAM的表達區分了人乳房上皮細胞中的兩種不同的亞群。EpCAM和CD49f的流式細胞術分析也能鑒定非致癌基底細胞系中的細胞亞群。MCF10A細胞顯示出異質性，包含兩個獨立的亞群（圖1E）：EpCAM + / CD49f +和EpCAM- / CD49f +。與MCF10A對照細胞（11.38±7.69％）相比，在MCF10A-SOX11細胞中觀察到EpCAM- / CD49f +基底樣群體的增高（27.44±14.58％）（圖1E）。 ALDH活性在EpCAM- / CD49f +基底樣MCF10A-SOX11細胞中比在MCF10A對照細胞中高1.76倍，表明了幹細胞相關亞群的擴增（圖1F）。在MCF10-SOX11細胞中檢測到EpCAM-/CD49f +/ALDH +細胞亞群比例比MCF10A-對照細胞中高4.26倍。
圖1.SOX11在出生後乳腺上皮細胞中的表達能夠改變其祖細胞亞群
SOX11表達對出生後MEC生長、形態發生和克隆形成的影響
作者發現，與MCF10A對照細胞相比，MCF10A-SOX11細胞生長能力輕微但顯著降低（圖2A）。在多種培養條件下，與生長的MCF10A對照組相比，MCF10A-SOX11形成的微球體能夠觀察到形態學差異。與對照相比，MCF10A-SOX11微球體顯得更緻密和堅實（圖2B）。這些效應與作者根據臨床證據所猜測的SOX11對MEC的生長調控作用相一致。與MCF10A對照細胞相比，MCF10A-SOX11細胞單克隆形成能力不強，但能形成更多具有基底/肌上皮形態的克隆（圖2C，D）。MCF10A-SOX11細胞具有更高的微球形成能力並且與MCF10A對照組形成的表型也不同（圖2C，D）。與MCF10A對照相比，MCF10A-SOX11微球體中的CC3（Cleaved Caspase 3）水平略微降低（圖2E）。
圖2.SOX11的表達對出生後乳腺上皮細胞生長、形態發生和克隆形成的影響
SOX11水平對DCIS的影響
DCIS.com細胞系是一種模擬DCIS形成及其向浸潤性疾病發展的細胞模型。作者將SOX11穩轉到該細胞中，來研究SOX11在DCIS中的作用。DCIS-SOX11微球體在形成時（第0天）在形態上與DCIS對照球體相似，但在14天後表現出輕微的體積減少（圖3A）。與對照相比，DCIS-SOX11細胞的生長能力稍微降低（圖3B）。作者將CC3水平作為評價微球體出現緊湊和壞死表型的指標。作者在DCIS-SOX11微球體中檢測到比在DCIS對照微球體中更低水平的Caspase 3活性（圖3C，D）。通過FACS分析，作者在DCIS-SOX11細胞群中檢測到比對照中高兩倍的ALDH活性（圖3E）。在DCIS-SOX11細胞中CD44 +/ CD24-亞群增加了1.5倍（圖3F）。與對照細胞相比，在DCIS-SOX11細胞中檢測到CD44 +/ CD24-/ALDH+細胞亞群增加7.7倍，CD44+/CD24+/ALDH+細胞亞群未檢測到顯著變化（圖3G）。在DCIS-SOX11細胞中檢測到的EpCAM-/CD49f+/ALDH+細胞亞群高於對照（圖3H）。
圖3.SOX11的表達對DCIS細胞的影響
SOX11在體外促進DCIS細胞的浸潤性生長
通過Transwell分析發現，與對照細胞相比，DCIS-SOX11細胞對基質膠的穿透能力更強。三維浸潤實驗的結果顯示SOX11增加了DCIS微球體的浸潤能力（圖4A，B）。最近的研究表明，PAM50測試中某個基因引起的黑素瘤抑制蛋白（MIA）在基底樣乳腺癌中特徵性地增高，並且在乳腺癌細胞中，由小干擾RNA介導的SOX11敲低時，MIA活性也顯著降低。MIA由惡性轉化後的黑色素瘤細胞分泌，在黑色素瘤的進展和浸潤中起關鍵作用。作者檢測MIA水平發現，DCIS-SOX11細胞比DCIS對照細胞的MIA水平高4倍。 MCF10A對照細胞和MCF10A-SOX11細胞檢測不到MIA表達。這些結果表明，當SOX11在成熟的ER-/PR-/HER2-乳腺細胞中表達時，可以導致深刻的表型變化，但浸潤性表型的獲得還依賴於細胞環境因素。
SOX11在體內促進DCIS細胞的生長和進展
作者採用由Behbod等開發的小鼠乳腺導管內注射（MIND）模型，將DCIS對照和DCIS-SOX11細胞注射到雌性小鼠的乳腺導管中。 6-7周後收集乳腺，並對其中的一部分進行切片。注射DCIS對照細胞的小鼠乳腺可以發現原位病變和一些微小浸潤（圖4C）。注射DCIS-SOX11細胞的小鼠乳腺具有廣泛的微小浸潤和浸潤灶（圖4D）。活體成像顯示，在異種移植後6-7周，在注射DCIS-SOX11細胞的小鼠乳腺中作者檢測到更多的生物發光（圖4E）。在異種移植後12周，作者收集了同一批小鼠的乳腺發現，注射DCIS對照細胞和DCIS-SOX11細胞均形成侵襲性腫瘤，在DCIS-SOX11腫瘤中觀察到明顯更多的生物發光，並且比DCIS對照細胞形成的腫瘤體積更大。對初期階段（注射後6-7周）的病變乳腺進行RNA測序顯示，細胞外基質（ECM）組分和細胞形狀調節相關基因的RNA表達失調，並且編碼與細胞生長相關的細胞因子和多肽的基因表達增加（表1）。將DCIS細胞注入乳腺導管12周後產生的侵襲性腫瘤的RNA測序顯示，編碼信號肽、ECM組分和胚胎器官形態發生調節相關基因表達增加（表2）。作者還將DCIS對照細胞和DCIS-SOX11細胞直接注射到雌性小鼠的乳房脂肪墊中。 IVIS顯像顯示注射細胞6周後，DCIS-SOX11細胞具有更多的生物發光和更大的腫瘤體積。在乳腺脂肪墊注射DCIS-SOX11細胞後形成的侵襲性腫瘤表現出與器官發生和發育過程相關基因的表達升高，具有與導管內注射相似的基因表達譜。作者鑒定了DCIS中與SOX11信號轉導相關的候選效應因子，包括與乳腺癌有聯繫的ALDH1A1和HORMAD1。 ALDH1是正常和惡性人乳腺幹細胞的標誌物，並且是臨床預後不良的指標。其中ALDH1A1亞型是癌症幹細胞標誌物，與臨床預後不良有關。HORMAD1表達增高能夠抑制RAD51依賴性同源重組並啟動其它DNA修復途徑。定量聚合酶鏈式反應（qPCR）分析顯示DCIS-SOX11腫瘤中的SOX11、FHAD1、HORMAD1和TFAP2B表達比DCIS對照腫瘤中的水平增高（圖5A）。IHC染色發現，在導管內注射DCIS對照細胞和DCIS-SOX11細胞（圖5B）6-7周後收集的早期病變中檢測到ALDH1A1+細胞。在將DCIS對照細胞注射到乳房脂肪墊後形成的腫瘤中，在腫瘤內部檢測到分散的ALDH1A1+細胞（圖5C）。而在DCIS-SOX11細胞形成的腫瘤中，作者在腫瘤內部以及腫瘤周邊檢測到大量的ALDH1A1+細胞簇（圖5C）。
圖4. SOX11提高了DCIS細胞在體外實驗中的侵襲活性，促進了DCIS細胞在體內的生長和進展
圖5.在小鼠模型中鑒定SOX11信號傳導的下游效應物
表1.導管內和脂肪墊注射DCIS對照和DCIS-SOX11細胞後形成腫瘤後（僅6周的樣本），RNA測序鑒定潛在的SOX11下游靶標
表2.在導管內和脂肪墊注射DCIS-對照和DCIS-SOX11細胞之後形成腫瘤後（6周和12周總樣本），RNA測序所鑒定的潛在的SOX11下游靶標
SOX11在進展為轉移灶的乳腺癌和侵入性乳腺病變中表達
作者發現SOX11表達水平升高與淋巴結陰性乳腺癌患者的預後不良相關，疾病進展形成遠處轉移的可能性增加，總體生存率下降（圖6A，B，Q1-Q4代表SOX11表達水平的增加）。在一小部分純DCIS病例（13/22 例ER-、6/17 例HER2+ 、1/22例ER+以及4/6例混合病例中DCIS和侵襲的部分）中，ER- DCIS病變相比於ER+ DCIS病變能檢測到更高水平的核SOX11表達（P = 0.0002）（圖6C，D）。
圖6.SOX11是一種胚胎期乳腺上皮標記物，它表徵乳腺癌患者的臨床預後不佳，並在乳腺浸潤性病變中表達
討論
作者研究了在正常乳腺細胞和DCIS細胞系（來自MCF10A進展系）中表達SOX11（一種胚胎期乳腺發育相關因子）所產生的效應。SOX11在MCF10A和DCIS.com細胞中表達並不顯著。作者的研究結果表明，外源的SOX11表達能夠在MCF10A細胞中顯著改變其祖細胞特徵，產生和成熟MECs不同的性狀。 SOX11表達導致基底樣細胞群體增高、人乳腺祖細胞標記物ALDH的活性在MCF10A細胞基底樣亞群內也顯著增加。這些發現表明，在成熟的MECs中，SOX11的表達增加了具有基底樣和luminal樣譜系特徵的細胞亞群。大部分出生前乳房細胞表達小鼠和人乳房上皮細胞中基底細胞譜系和luminal細胞系相關的標誌物。在MCF10-SOX11細胞中，基底樣形態的克隆微球體形成能力有所提高，這與ALDH+正常乳腺細胞具有幹細胞特性的理論相一致。與對照相比，MCF10A-SOX11細胞的生長能力發生輕微缺失，並且不具有侵襲性。 說明SOX11在正常出生後MECs中的表達改變了祖細胞特徵和其形態的發生，但沒有促進侵襲。
對導管內注射過表達SOX11的DCIS.com細胞後形成的病灶進行表達譜測序，鑒定出了在微浸潤和浸潤生長階段表達的大量SOX11下游效應物，許多與幹細胞生物學和胚胎髮育過程有著重要的聯繫。ALDH1A1在正常乳腺乳腺祖細胞的增殖和分化中起重要作用， ALDH1A1敲低後可導致克隆形成減少。 TFAP2B被認為能夠刺激細胞增殖並抑制胚胎髮育期間特定細胞類型的終末分化。 TFAP2B突變則引起Char綜合征，這是一種以心臟、顱面和肢體發育缺陷為特徵的疾病。 癌/睾丸基因由生殖細胞表達，在體細胞中處於靜息狀態，但在各種癌症中被激活，其中CT46 HORMAD1是一種減數分裂基因，是三陰乳腺癌同源重組缺陷的驅動因子。
DCIS-SOX11細胞形成的病灶中，發現許多上調的基因編碼ECM組分或ECM調節因子，包括信號肽和分泌型生長因子。 ECM在癌症中被高度修飾，並且可以促進原發性腫瘤或轉移性腫瘤的發展。SOX11可能通過產生ECM裂解產物（包括具有潛在信號傳導功能的信號肽和局部釋放的生長因子）而促成DCIS.com細胞浸潤性表型的增多。綜上所述，作者的研究結果表明，乳腺癌病灶中SOX11的表達能夠改變祖細胞/幹細胞群體、促進組織重塑併產生浸潤傾向。
SOX11在許多其他癌症中表達，包括神經膠質瘤、肺癌、套細胞淋巴瘤（MCL）、卵巢癌和前列腺癌。SOX11在大多數侵襲性MCL中異常表達，被認為是MCL中可靠的病理學標誌物。SOX11在基底樣和HER2+乳腺癌中表達最高，但是還需要進一步的研究來評估它是否能夠成為臨床上有價值的標誌物。
作者的研究結果表明過表達SOX11對MCF10A系列乳腺細胞的影響是依賴於細胞環境的。 外源表達SOX11的DCIS.com細胞，浸潤性生長顯著增加，但是在MCF10A-SOX11細胞中卻沒有這些效應。 DCIS.com細胞是由H-Ras轉化的MCF10A細胞克隆衍生的。因此似乎證明，如果沒有表達諸如HRAS這類惡性驅動因子，SOX11將不會促進浸潤性生長。 作者鑒定了在非惡性MCF10A細胞向惡性DCIS.com細胞轉化期間三種可能的惡性驅動突變（EPHA7，MAP3K12和PCSK5），它們也可能參與構築SOX11相關性浸潤生長的細胞環境。
最近對DCIS和早期浸潤性乳腺癌的分子研究發現，在純DCIS和浸潤性腫瘤標本中，SOX11具有高表達水平。SOX11高水平表達主要在基底樣和HER2+標本中檢測到。DCIS有一種亞型，其表達一組與進展期腫瘤相似的基因。SOX11常常與這些惡性基因共表達。對這些基因的功能注釋顯示，在該DCIS亞型中，這些基因與發育過程和器官形態發生有密切關係。使用DCIS.com細胞的體外和體內研究顯示，SOX11能夠促進細胞存活和DCIS細胞的浸潤，並且增加了ALDH+群體的大小，包括CD44+/CD24-/ALDH+亞群。 CD44+/CD24-/ALDH+表型常被認為能夠增加乳腺癌細胞的致瘤性。總的來說，這些發現支持了這樣的觀點：SOX11在DCIS病灶中的表達使其更具侵襲性，並能使其進展為浸潤性乳腺癌。
通過IHC檢測發現，在ER-DCIS病例中59％是SOX11+。高水平的SOX11表達與乳腺癌患者的整體生存率較差相關，而淋巴結陰性患者中，高水平SOX11也預示著較差的預後——通常這一組患者預後良好。但是，用於生存分析的數據集不能代表DCIS。為了確定DCIS中的SOX11過表達是否與發展為浸潤性乳腺癌的風險相關，需要分析大量長期隨訪的純DCIS樣品。Sloane是全英國篩查DCIS的前瞻性審計項目（www.sloaneproject.co.uk）。LORIS是英國的一項III期臨床試驗項目，它對比了低風險DCIS的手術治療和長期主動監控。這兩項計劃將評估SOX11的臨床價值，以及其與DCIS進展為浸潤性乳腺癌的相關性。
作者將SOX11的表達與DCIS細胞發展為浸潤性生長相聯繫，在DCIS中鑒定了SOX11的潛在下游效應因子，增加了新的生物學信息，這可能有助於更好地理解SOX11陽性乳腺病變患者的病理學特徵，進而選擇適合的治療手段。 SOX11是ER- DCIS潛在的生物標誌物，它的表達可能意味著更高的惡化風險。 需要進一步的研究來確定SOX11+ DCIS患者是否更可能發展成浸潤性腫瘤。
原文題目：SOX11 promotes invasive growth and ductal carcinoma in situ progression
原文出處：The Journal of Pathology
原文鏈接：europepmc.org/articles/PMC5637904
原文作者：Erik Oliemuller1, Naoko Kogata1, Philip Bland1, Divya Kriplani1, Frances Daley1, Syed Haider1, Vandna Shah2, Elinor J Sawyer2 and Beatrice A Howard1*
1 The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre, Division of Breast Cancer Research, The Institute of Cancer Research, London, UK
2 Research Oncology, Guy"s Hospital, King"s College London, London, UK
*Correspondence to: BA Howard, The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre, Division of Breast Cancer Research, The Institute of Cancer Research, London, SW3 6JB, UK. E-mail: beatrice.howard@icr.ac.uk.
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