宋元林：目前呼吸系統感染性疾病的病原微生物檢出率不能滿足臨床需求，且看微生物分子診斷前景

最新 01-13

目前呼吸系統感染性疾病的病原微生物檢出率仍然不能滿足臨床的需求。痰培養加塗片的陽性率50%左右，血培養的陽性率10-15%。上呼吸道感染，慢阻肺急性加重等的病原學確診率更低。這些未能臨床確診的病例，以及在危重病患者由於強調早期應用廣譜抗生素，使得抗生素的使用更加普遍，導致耐葯菌的檢出率普遍攀升，耐葯菌感染治療療效較差，死亡率升高。常規微生物實驗室確診臨床診斷比例低的原因是由於傳統檢測方法的局限性，在取標本之前應用了抗生素等。因此，發展不依賴於傳統培養的微生物分子診斷技術將有助於感染性疾病的診治，提高診斷率，改善治療的預後。

常見病原微生物

微生物病原學診斷的二代測序技術

根據病原微生物的核酸（DNA，RNA），細胞壁成分等可以診斷病原微生物。分子診斷的方法包括用引物放大核酸分子，再進行測序（NGS）。基於16sRNA的檢測技術是根據16sRNA在不同菌種之間存在共性保守序列，同時存在可變序列用於菌種之間的鑒別，採用定量熒光PCR技術可以很好地擴增樣本中的核酸，用於微生物種屬的鑒定。缺點是不能區分死亡與存活的微生物。另外，由於技術本身的限制，仍然存在錯配導致特異性有一定的變異。

PCR，RT-PCR，Term-PCR等改良技術陸續用於微生物的鑒定，在流感病毒檢測中發揮了重要作用。目前可以做到2小時內出報告。二代測序技術則直接通過基因序列分析（核酸提取後建庫），測序後與樣本庫中的病原微生物進行比對，從而判斷微生物的種類。目前在咽拭子，肺泡灌洗，血液，胸水，痰液等標本中都得到了應用。該技術目前最快24小時內出報告，但成本相對較高。為提高檢測的靈敏度，把引物粘附在納米顆粒上，增加反應的面積，或接種於微流控微孔中，以及事先在平板上鋪設特異性較強的引物等，這些改良方法極大提高了檢測的高通量，敏感性和特異性等問題。

微生物檢測需要注意什麼

微生物檢測方法學的靈敏度與特異性，跟診斷感染的敏感性和特異性是兩個概念。從收集標本到診斷取材部位的感染狀態需要進行嚴格的質量控制，防止標本污染，有效提取核酸（細胞破壁），以及確定診斷感染指標的理想截斷值是微生物分子診斷的核心。大多數情況下，局部正常菌群的存在干擾了對結果的判斷，因此，除了考慮去除菌群的背景，增加耐葯基因檢測，以及病原體毒力因素的檢測有助於判斷病原微生物是定植還是感染。

病原微生物診斷的未來

未來病原微生物的診斷是傳統方法學繼續改良，分子診斷和新的診斷方法有效補充，尤其是常規檢測陰性的標本。根據病變部位的感染金標準來界定分子診斷的閾值，完善標本採樣程序，避免污染並提高核酸提取效率，簡化並加快檢出速度，降低檢測的成本，並開發適合不同標本和疾病檢測的panel, 使感染的診斷更加個體化，以及檢測病原微生物的毒力因子，耐葯基因等是發展趨勢。另外，分子診斷結合高通量檢測病原微生物將有助於微生態研究的進一步開展，在菌群研究和致病機制探索，調控菌群治療炎症和免疫性疾病上會有新的拓展。

作者介紹