《Science》綜述：基因治療時代的到來

基因治療經歷30年的挫折後，目前正在迅速發展，成為治療人類各種遺傳性和獲得性疾病的關鍵組成部分。基因治療遺傳性免疫系統疾病、血友病、眼睛和神經退行性疾病，給人類帶來了很大的希望。

1月12日，《Science》雜誌發表了基因治療最新綜述，討論了基因治療發展中的里程碑，突出闡述了為基因治療領域的成功奠定基礎的關鍵發展，側重於體內治療的病毒載體和基因工程T細胞或造血幹細胞的移植；同時，研究了將來有可能改變基因療法的靶向基因組編輯的最新進展。

基因療法為多種醫學領域帶來新的治療選擇。四十五年前，Theodore Friedmann提出了用基因療法治療遺傳病的潛力和挑戰的預言（1）。人類對基因治療興趣的日益增長，至少在理論上承認：單一治療可能實現持久的、潛在的臨床治效。

研究人員推測，與蛋白質類藥物需要反覆輸注相比，基因治療輸注長壽命細胞可能會持續產生內源性蛋白質，例如血友病的凝血因子（2）。例如，轉基因造血幹細胞（HSC）可以持久緩解的條件範圍內，避免終生服用酶或輸血治療（3,4）。

最初，基因治療被認為是一種治療遺傳性疾病的方法。現在，基因治療正被應用於後天性疾病，基因工程T細胞用於治療癌症是最好例證。最近的臨床研究發現，單次輸注嵌合抗原受體T細胞可以在一個亞群的患者中產生持久的反應（5）。

將基因治療的概念轉化為臨床治療，始於上世紀90年代初期，但由於反覆的樂觀情緒和令人失望的臨床試驗結果而飽受折磨。一些早期的臨床試驗發現，沒有療效或產生意外的毒性導致某些病例死亡，而被廣泛宣傳（6）。1996，美國國立衛生研究院（NIH）諮詢小組得出結論，這些令人失望的臨床結果是由於對病毒載體、靶細胞和組織以及疾病的認識不足造成的。諮詢小組建議研究人員重返實驗室，關注基因治療方法的基礎科學研究（7）。新載體的開發和對靶細胞的進一步了解，引發了20世紀90年代末和21世紀初的第二代臨床試驗。這些試驗證明，在某些情況下，靶組織持續的基因修飾可以獲得臨床獲益。然而，由於基因轉移效率高導致的嚴重毒性，使基因治療的進步再次放緩；例如：插入基因毒性，轉基因細胞的免疫破壞，某些載體相關的免疫反應（6, 8, 9）。

在過去的10年中，基因治療在「科學」研究、安全性的改進，基因轉移效率和輸注的進一步成熟，最終推動了大量的臨床進展。美國和世界各地的監管機構，已經批准一些基因和基因修飾的細胞療法成為藥物，還有十多項獲得了「突破療法」稱號。

基因工程從病毒載體到基因組編輯

重組、複製缺陷型病毒載體是第一個有效、無毒的基因轉移到人體細胞的分子工具（10）。逆轉錄病毒和腺相關病毒（AAV）最有臨床前景，我們的僅討論這些載體。

逆轉錄病毒載體

基因組包裝信號（11）的識別和產品細胞系（12）的建立，為設計和生產能夠進行反轉錄和DNA整合，同時缺乏複製潛力的載體，鋪平了道路（13, 14）。二十世紀80年和90年代早期，證明開發的g型-逆轉錄病毒載體可以將基因導入再生的造血幹細胞（15-17）。C型-逆轉錄病毒可以將有效的基因導入原始T淋巴細胞（18-21）。第一代的臨床試驗設計使用這些載體，轉移一個特定的缺陷基因進入免疫缺陷病或癌症患者的T細胞或造血幹細胞的基因組，（reviewed in (22)）（圖1）。

圖1。造血幹細胞基因治療的歷史回顧。HSCT: 造血幹細胞移植；HSC: 造血幹細胞；SCID: 重症聯合免疫缺陷；NHP：非人靈長類動物；ZFN:鋅指核酸酶；TALEN: 轉錄激活因子樣效應物核酸酶；CRISPR / Cas9：規律成簇間隔短迴文重複序列（CRISPR）–CRISPR相關9（cas9）核酸酶。

隨後，兩個其他屬的逆轉錄病毒加入到載體系列：慢病毒（lentiviruses）（23）和泡沫病毒（spumaviruses）（24）。與g型-逆轉錄病毒載體不同，慢病毒載體可以將基因導入處於不分裂的G0期的靜止細胞（25）。慢病毒載體可以攜帶更大更複雜的基因盒，因此，它們為血紅蛋白病的治療提供了重要進展（26）。慢病毒載體和泡沫病毒載體的另一個優點，它們優先整合到基因的編碼區。相比之下，g型-逆轉錄病毒載體，可以整合到基因5′-非翻譯區（27），增加了造血細胞致癌基因插入突變的潛在風險（28）。Lentiviruses載體是目前大多數造血幹細胞應用的首選工具，但g-retroviral載體仍然是用於工程T細胞和造血幹細胞基因治療某些應用（表1）。使用「自我失活的SIN設計，去除慢病毒載體和g-retroviral載體的內源性強增強子元件，是降低遺傳毒性的風險的另一種方法（30）；目前大多數臨床試驗採用這種設計（表1）。對整合型逆轉錄病毒載體進行詳細的綜述（31, 32）。

腺相關病毒（AAV）載體

AAV載體來自於一種非致病性，無包膜的細小病毒，天然具有複製缺陷。野生型AAV需要另一種病毒，如腺病毒或皰疹病毒，完成複製（33, 34）。AAV s病毒載體的所有編碼序列可以由一個感興趣的基因表達盒的替代。AAV載體的一個限制是，不能容納超過5 kb的DNA（g-retroviral或慢病毒載體，可容納>8 kb DNA）。AAV載體主要是非整合性型；轉移的DNA作為遊離基因是穩定。這一特點降低了整合風險，也限制了腺相關病毒載體在有絲分裂後細胞內的長期表達。

在20世紀90年代中期，兩個研究小組證實，小鼠肌肉注射AAV載體後，轉入的基因在小鼠體內長期表達（35, 36）。這一開創性的工作證實，在動物模型中，AAV載體可以有效地轉染各種靶組織，包括肝臟、視網膜、心肌和中樞神經系統，具有特定的組織感染傾向，發現天然存在的AAV血清型和具有優化外殼的AAV工程型（37）。綜述改進AAV載體製造技術（38），增加AAV載體產量和產品純度，大動物疾病模型上進行概念論證研究（圖2）。上世紀90年代末，啟動了開創性的AAV基因治療B型血友病的臨床試驗，首先測試AAV載體肌肉注射（39），然後靜脈注射，利用AAV2的肝臟傾向（40）。這些早期的實驗建立了安全的但劑量不足治療，並出現抗AAV的免疫反應，最有可能的原因是，很多人攜帶了針對病毒衣殼的中和抗體和記憶性T細胞。如下面所述，充分利用AAV載體的治療潛力，需要嚴格分析抗AAV免疫反應（41），包括針對一系列血清型AAV載體的細胞和體液反應（42）。

圖2. AAV基因治療血友病的歷史回顧。AAV：腺相關病毒載體；FVIII：VIII因子；FIX：IX因子；Mfg：製造業。

基因組編輯

與病毒載體僅可以介導一種基因修飾（「基因添加」）不同，新的基因組編輯技術可以介導基因添加、基因刪除、基因校正，以及細胞內其他高度靶向的基因組修飾。基因組編輯可以在體外細胞上進行，也可以在體內進行原位基因組編輯。靶向DNA替代是由一個核酸酶誘導雙鏈DNA斷裂引發（DSB），可以激活哺乳動物細胞中的高效重組（43）。非同源末端連接（NHEJ）–介導的修復，可以在DSB位點有效的產生不同長度的插入片段或刪除突變（InDel），通常導致基因功能失活。同源定向修復（HDR），在同源供體DNA模板的存在下產生特定的替代序列，重組後在特定位點糾正突變或插入新序列（44）。

早期的基因組編輯研究，依賴於特定的鋅指核酸酶（ZFN）（45）或超級核酸酶（46），在DNA靶位點誘導所需的DNA雙鏈斷裂（DSBs）。這些核酸酶平台需要專門的知識，定製特異的結合核酸酶效應蛋白切割靶DNA，這限制了鋅指核酸酶的廣泛應用。2009年證實，細菌蛋白的DNA結合區稱為轉錄激活效應區（TALEs）很容易改變（47, 48），為產生TALE核酸酶（TALENs）打開創造之門（49, 50）。這些酶能有效地切割任何感興趣的DNA序列（51）。然而，TALEN的方法仍然需要為每個新的靶向DNA設計兩條特定的核酸酶。

2012年，基因組編輯發生巨大的改變， Doudna和Charpentier開創性的發現，細菌防禦系統由成簇規律間隔短迴文重複（CRISPR）–CRISPR 相關核酸酶9（cas9），CRISPR- Cas9核酸酶可以有效地、程序性切割DNA位點，只需設計一條與感興趣的目標位點互補的、特定的、短鏈指導RNA（gRNA）（52）。CRISPR-Cas9核酸酶技術迅速擴展到哺乳動物細胞（53, 54），從而簡化基因組編輯過程（55）。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶，可以很容易地重編程切割特定的DNA序列，現在廣泛用於無數的基礎研究中（56-58）。一些最終可以應用於臨床的聰明策略，涉及使用RNA引導的催化Cas9活性（「死亡Cas9」或dcas9），通過阻斷轉錄機制或招募表觀遺傳調控因子來打開和關閉基因（59, 60）。最近報道，在單鹼基水平校正突變針對Cas9 -為基礎的「基礎編輯」（61, 62）。

基因組編輯方法為糾正或改變基因組提供了一個精確的手術刀，可以克服依賴於病毒載體介導的半隨機基因組插入策略的許多缺點。例如，基因毒性由於鄰近的原癌基因的異位激活、腫瘤抑制基因的敲除或正常剪接的紊亂，基因突變不應發生在靶基因編輯。此外，外源基因/校正基因將受內源啟動子的調控，導致更多的生理調控基因表達（63）。肝細胞中高活性白蛋白啟動子下游靶向引入凝血因子基因，在動物模型中看到希望（64）。基因組編輯策略的潛力，通過可變剪切突變的肌營養不良蛋白基因，或直接糾正肌營養不良蛋白突變，繞過肌營養不良症的病理學，已經在臨床前模型中得到證實（65-67）。最後，由於顯性失活突變所引起的疾病，不能通過基因添加來治療，因此應服從基因校正策略。

將基因編輯所需的所有組件輸送到細胞內存在挑戰。NHEJ導致的基因突變最簡單，只需要靶向核酸酶，超級核酸酶，ZFN，或TALEN技術，或核酸酶加gRNA的CRISPR方法；這些組件可以通過非整合病毒載體或轉染mRNA或RNA蛋白質複合物進入靶細胞，如體外的造血幹細胞。然而，通過HDR的基因校正需要供體DNA，輸送更加困難，HDR似乎在某些靜止的細胞類型如長期再植造血幹細胞是無效的（68, 69），雖然正在取得進展（70）。

基因組編輯作為一種治療手段正在迅速發展到臨床（表1）。ZFN已經用於破壞在人類T細胞（71）和HSCs（72）中的表達的CCR5（C-C類趨化因子受體5型）基因，這些細胞可以對抗HIV感染。I / II期T細胞CCR5編輯研究已經完成（73），I期臨床試驗HSC編輯正在進行中（NCT02500849）。TALENs已經用於製造「現成的」第三方抗-CD19嵌合抗原受體（CAR）的T細胞，不太可能導致移植物抗宿主病（GVHD）。這是由T細胞受體基因缺失引起的。這些修改後的細胞治療2例難治性急性B細胞白血病，腫瘤反應的證據（74），正在進行I期臨床試驗（NCT02808442）。此外，早期的試驗已經開始，異體TALEN編輯CAR T細胞靶向CD123，治療急性髓系細胞白血病和急漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（NCT03190278）。FDA批准ZFN介導的、體內插入肝細胞白蛋白基因的三項基因治療臨床試驗的啟動：提供B型血友病凝血因子IX基因（NCT02695160），粘多糖貯積症I，a- L -iduronidase基因（NCT02702115），粘多糖貯積症II a- L - iduronidate-2-硫酸酯酶基因（MPSII）（NCT03041324）。第一個病人通過體內基因組編輯，最近參加了MPS II試驗，編輯組件通過AAV載體靜脈輸液到肝臟。中國監管機構的至少已經批准9個使用CRISPR-Cas核酸酶臨床試驗，主要是為了在腫瘤靶向T細胞中敲除PD1的表達，據報道，已經有幾位患者入組。

與標準的基因轉移方法相比，基因組編輯特別是基於CRISPR-Cas核酸酶的基因編輯，正處於轉化和臨床初級階段。一些潛在的可行性和安全性的障礙，可能影響臨床應用；這些都需要在適當的模型上進行深入的臨床前研究和精心設計的臨床試驗。例如，在替代位點，由於核酸酶介導的NHEJ或HDR，「脫靶」突變的程度正在進行緊張的研究。相關的研究問題，如何設計最優的核酸酶或CRISPR gRNAs，避免脫靶切割？臨床應用之前或應用期間，如何預測、篩選、檢測基因組中靶和脫靶（75）？值得注意的是，最近已研發出沒有或很少檢出的脫靶效應的高保真CRISPR-Cas9核酸酶（76-78）。體內的基因組編輯核酸酶的免疫原性仍然存在問題，為了保證基因編輯組織的靶向性，要進行靶向傳輸。

CAR療法

工程T細胞正在成為強有力的癌症藥物（圖3）（5）。嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors，CARs)是人工合成的基因工程受體，抗原，在一個單一的分子中整合了T淋巴細胞的特異性、功能和代謝（124, 125）。CAR由抗原結合結構域，來自於一個免疫球蛋白分子或一個T細胞受體，融合為一個細胞內信號轉導結構域，介導激活和共刺激以增強T細胞功能和持久性。與抗原的生理受體不同，CARs可以被工程化設計，識別蛋白質和碳水化合物的糖脂，以及HLA多肽複合物（126, 127）。體外，CARs轉染進入T細胞，從而產生可擴增的抗原特異性T細胞。激活內源性T細胞的主動免疫屏障和增加動力學。CAR-T細胞的生成需要穩定的基因轉染，確保CAR在分裂和穩定的T細胞中持續表達。

圖3.CAR-T細胞療法的歷史回顧。CAR：嵌合抗原受體；cGMP：現行良好製造規範；DLI: 供體白細胞輸注；LAK: 淋巴因子激活的殺傷細胞；Mfg：製造業；NK:自然殺傷細胞；TIL：腫瘤浸潤淋巴細胞。

g-retroviral載體原本是用來證明CARs針對CD19，在大多數 B細胞淋巴瘤和白血病發現的細胞表面抗原，可以消除免疫缺陷小鼠體內腫瘤（128）。目前，CD19是最常見的CAR的靶標，成為CAR治療模式（圖3）。難治性瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL），慢性淋巴細胞白血病，成人和兒童急性淋巴細胞白血病（ALL），已得到持久的反應（見表1）。總的來說，對CD19 CARs的臨床前和臨床研究採用不同的載體系統（慢病毒載體，轉座子，mRNA，CRISPR-Cas9）（129），CARs設計（130, 131），與T細胞亞群（132, 133），已經驗證了CARs的概念（5, 126）。值得注意的是，CAR-T細胞治療，伴隨嚴重的全身毒性，往往需要重症監護，在某些情況下造成病人死亡。研究人員正在集中精力更好地理解，減輕和治療這些併發症，其中包括腫瘤脫靶作用及細胞因子釋放綜合征（CRS），以及了解甚少的神經毒性（134, 135）。

CD19 CARs在難治性ALL和難治性瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）臨床受益， 2017 年，FDA批准兩個基因工程細胞的產品，是美國首次批准。其他幾家CARs獲得了FDA治療B細胞惡性腫瘤的突破性療法（表1）。CAR治療多發性骨髓瘤的早期臨床數據也是令人鼓舞的（136）。目前的研究目標是將CAR治療擴大到髓系惡性腫瘤和實體瘤（137, 138）。這些疾病帶來了挑戰，因為可靠的腫瘤特異性細胞表面抗原尚未得到驗證。此外，需要一個方法，有助於CAR-T細胞進入較大腫瘤或免疫特權區域，克服腫瘤微環境信號。通用第三方CAR-T細胞，可以使用「現成的」CAR-T細胞，與患者的自身特異性T細胞相比，將提供更快速和更便宜的治療。T細胞缺乏內源性T細胞受體和/或主要組織相容性複合體分子，以減少GVHD和排斥的風險，在臨床前或早期臨床研究，作為邁向這一目標的第一步（62, 73）。CAR-T細胞已經對某些癌症治療具有很大的影響（139），這一成功為未來T細胞為基礎的治療其他癌症和其他疾病如自身免疫性疾病和艾滋病的治療（5, 140），提供了基礎。

結論

根據概念驗證的臨床研究證明治療有效，基因療法目前正在加速臨床轉化和商業發展。然而，未來仍有很多挑戰，包括解決整合基因載體的遺傳毒性或關閉靶向基因組編輯，提高基因轉移水平或基因組編輯效率，解決體內對載體的免疫反應，並對如基因組編輯的倫理爭議和昂貴的治療費用等問題達成社會共識等。

學術界和工業界的研究人員正在與監管機構和實體合作，開發和標準化用於分析測定載體製劑的效力和安全性及產品放行標準；基因編輯的科學進步也不斷湧現，正在加速未來的臨床轉化和商業化開發。未來，基因治療的新付款模式也將成為研究重點。

科學家和臨床醫生從事基礎、轉化和臨床研究的工作，在政府和慈善機構的支持下，創新技術或改進技術將不斷湧現。人類有理由保持樂觀和繼續努力，基因治療將成為人類嚴重疾病的重要治療手段。

備註：文中所標註的參考文獻，詳細信息可查閱綜述原文《Genetherapy comes of age》

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