動物實驗替代技術研究進展
綜述了動物實驗替代技術的發展及法規接受情況。介紹了替代動物實驗的歷史，闡述了在21世紀毒性測試新觀念（TT21C）、有害結局通路（AOP）、整合測試等理論的指導下，組織重建和多器官人體晶元技術、幹細胞技術、組學技術、非生物測試技術、高通量和高內涵技術等新技術對動物實驗替代方法的促進分析了標準化的替代方法和個性化的體外方法在化學品、化妝品、藥品和生物製品等健康相關產品評估中的應用。分析表明，替代技術不僅是實驗動物學科的重要分支，也是一類研發和實驗用的創新性工具，同時具有產業化的前景。
實驗動物在醫學和生物學發展中做出了重要的貢獻。但無法否認的是，雖然人類通過動物實驗獲得了科學研究或實驗數據，然而實驗動物卻不可避免地受到了生理或心理上殘酷的傷害甚至死亡。早在20世紀50年代，實驗動物學科興起之初，就有學者提出了這樣的疑問：無限制的動物使用是否必要？仁慈的動物實驗需要建立什麼原則？之後，Russell和Burch系統地提出了減少（reduce）、優化（refine）和代替（replace）動物實驗的3R理論，成為實驗動物學科發展的基礎。特別是進入21世紀以來，替代技術在毒理學與藥物開發中取得的進步，使其逐漸成為研究熱點和新興的學科分支。3R理論提出近60年來，簡單可區分為3個階段用。
起步和積累階段（1959—1990）
實驗動物替代技術源於19世紀初在西方國家興起的動物保護和動物福利運動，以1822年英國政府發布的《馬丁反殘酷法案》為起點。西方動物保護和試驗用動物福利研究逐漸得到重視，英國動物福利大學聯盟（UFAW）於1954年啟動了實驗室仁慈技術研究的項目，項目結束之後的1959年，（Russell）和（Burch）在總結調研報告的基礎上出版了著名的《The principles of humane experimental technique》（《仁慈實驗技術原理》）。系統提出了3R原則，即通過使用無知覺的材料代替（replace）有意識的活體高等動物，在確保獲取一定數量和精度的信息前提下盡量減少（reduction）動物使用量，採取優化措施（refinement）減輕動物痛苦的發生和嚴重程度。提出了相對代替和絕對代替的概念，指出可利用低等動物、高等植物、微生物方法和生化檢測的方法代替動物測試，並極具遠見性地提出充分開發組織培養的觀念。1978年，David Symth在《Alternatives to animal experimentation》（《替代動物試驗》）一書將3R統稱為替代(Alternatives)，這個定義已被人們廣泛接受。
3R理論提出以來，開拓了人們理性投入生命科學研究的思路，使得仁慈科學成為良好科學的前提，並激勵科學家投入替代技術開發。3R原則一直影響著世界各國有關實驗動物法規。目前，西方大多數國家的《實驗動物福利法》均引入了3R原則。中國科學技術部2006年發布了《關於善待實驗動物的指導性意見》。3R原則還影響到一些部門規章或行業法規的制定以及為數眾多的生物醫學研究中科研計劃與實驗程序的論證和實施程序等。例如歐盟《86/609/EEC保護用於科學目的的動物的歐盟議會和理事會指令》、中國的《GB/T27416—2014實驗動物機構質量和能力的通用要求》等。科研人員必須在動物福利法規的框架範圍內享有學術自由和最優地使用動物。
1969年，英國成立了醫學試驗用動物中替代法基金會（FRAME）成為全球最早的替代方法研究機構，1981年，美國霍普金斯大學公共衛生學院成立了動物實驗替代方法研究中心（CAAT）；除了政府投入之外，化工、醫療、生物等行業協會和企業也投入大量人力和經費研發替代方法。在化妝品局部毒性測試領域，最早出現了利用離體大鼠皮膚、牛和豬的角膜、兔和雞的眼球、血細胞進行皮膚刺激、眼刺激的技術和方法。20世紀80年代，體外細胞分離培養技術已趨於成熟，無血清培養技術也開始出現，利用細胞進行檢測和實驗的方法被開發出來，如在生物製品動物實驗中，發明了組織培養技術代替非人靈長類測試脊髓灰質炎疫苗的技術。1989年，斯堪的那維亞細胞毒理學會啟動了評價急性毒性體外方法的項目，通過上千種化學物質的測試，發現嚙齒類動物的急性經口毒性與細胞毒性之間存在線性關係，提出了用細胞毒性預測急性經口毒性的方法。有的學者嘗試優化動物實驗程序，達到減少動物實驗的目的，如開發了急性經口毒性的上下程序法、分類法和固定劑量法；德國學者發明了利用細胞毒性檢測光毒性的方法，還開發了利用廢棄的動物材料（牛角膜）進行眼刺激毒性測試的牛角膜混濁和滲透性方法（BCOP）；也有學者開始嘗試體外三維構建人工皮膚替代物，用於化學品的皮膚刺激性測試。這些新穎的體外方法首先在開發機構和行業內得到應用，但面臨標準化、驗證和法規接受等難題。
法規接受階段（1991—2012）
驗證認可機制
1991年，歐洲替代方法驗證中心（European Center for Validation of Alternative Methods，ECVAM）成立（2011年更名為替代動物實驗歐盟聯合參考實驗室，EURL-ECVAM）。1993年，美國成立了由17個部委參與的替代方法驗證部門間協調委員會（Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM），ICCVAM依據美國國會發布的《ICCVAM授權法案》行使職責，主要是技術協調和評估新研發的和修訂的替代方法。1994年世界經濟合作和發展組織（OECD）開始編製替代方法的驗證指南。2005年，日本替代方法驗證中心（Japanese Center for the Validation of Alternative Methods，JaCVAM）成立。近年來，韓國、印度和巴西的替代方法中心也相繼成立。這些官方機構的成立旨在從國家和國家聯盟的層面推動替代技術的進步，並協調和加快替代方法法規接受的步伐。隨著ECVAM的成立，一些成熟方法開始進入驗證和法規認可過程。1992年，ECVAM開始驗證3T3細胞中性攝取光毒性測試方法，1994年，開始驗證皮膚模型代替皮膚刺激性動物實驗的體外方法。驗證機構的成立，使得大量研發投入產生的新技術、新方法和新產品有了被法規認可的渠道，推動了替代技術的進步。
全球法規趨勢
替代技術的興起和取得的進步，推動著立法禁止化妝品動物實驗走向議事日程。化妝品的動物實驗禁令起始於20世紀90年代，早期發展緩慢，近10年來呈現井噴勢頭（表1）。歐盟早在1993年就開始了禁令的討論，到1998年只有英國率先實施了化妝品動物產品測試禁令。2003年歐盟通過了2003/15/EC指令提出逐步淘汰動物試驗的時間表；2004年3月，歐盟禁止了化妝品成品的動物試驗；2007年，以色列實施了產品測試禁令；2009年3月，歐盟禁止了化妝品成分的動物實驗，僅限於一些最為複雜的人類健康效應可進行動物試驗（如重複劑量系統毒性、皮膚致敏、致癌、生殖毒性和毒代動力學）；2013年3月11日起，歐盟完成了化妝品及成分的動物試驗禁令和銷售禁令的實施。
表1 世界各國實施化妝品動物實驗禁令/限令的時間
歐盟的立法和令行禁止對全球法規和替代方法的研究帶來深遠的影響。緊隨其後，挪威、巴西2014年通過了70/2014法案，並於2017年3月進行了修訂。澳大利亞於2014年及2016年先後提出兩套終止殘忍化妝品的相關法案，從2017年7月起實施化妝品動物試驗及銷售禁令。紐西蘭於2015年通過《動物福利法》修訂案，禁止在化妝品及成分研發、製造、測試和教學中使用動物實驗。以色列繼2007年實施化妝品試驗禁令之後，於2013年1月起，實施銷售禁令。印度自2014年5月和11月，分兩步實施了禁止化妝品動物檢測和禁止進口經動物檢測的化妝品。土耳其規定從2016年1月開始禁止化妝品成品和原料的動物實驗。俄羅斯在2015年8月提交了提案，計劃2020年實施，目前這個議案發回修改。中國台灣省於2016年通過，自2019年起禁止化妝品成品及原料動物實驗。韓國則在2017年2月起實施了禁止化妝品動物實驗的新法規，但提出了很多豁免條件。瑞士2016年宣布與歐盟採取一致原則。瓜地馬拉在2017年2月國會上通過了化妝品動物實驗禁令。
全球還有十幾個國家目前正在立法的討論進程中。例如美國於2015年提出人道化妝品法案，目前有155個席位的支持。2015年，加拿大參議院提出零殘忍化妝品法案議案S-234, 2016年改為S-214，計劃在加拿大境內禁止進行化妝品動物實驗，並禁止銷售經動物實驗測試的化妝品原料和成品。此外，阿根廷、智利都有相關提案提出。全球目前有38個國家/地區已經正式實施了化妝品動物試驗禁令。相信不久的未來，化妝品動物實驗禁令會是全球重要經濟體的一個共同原則。
化學品方面，歐盟2006年發布的REACH法規（化學品註冊、評估、許可和限制制度）明確提出採用經驗證的替代法來避免動物實驗，鼓勵研究新的非動物實驗方法並在將來的法規中進行修改。2013年1月1日，歐盟27國開始實施新的保護試驗用動物指令2010/63/EU，指令提出最終目的是完全替代科研和教學中的動物實驗。新指令明確和重申了3R原則，呼籲委員會和成員國推廣替代方法，鼓勵成員國參與替代方法的驗證等。
方法接受情況
科技進步始終是動物實驗替代方法得以快速發展的驅動力量，表2列舉了近15年來已獲認可或已向OECD提交草案的毒性測試替代方法，這些方法包括皮膚腐蝕試驗、皮膚刺激試驗、經皮膚吸收試驗、眼刺激試驗、皮膚過敏試驗、光毒性試驗、內分泌干擾試驗、胚胎毒性試驗、血液毒性試驗、遺傳毒性等毒理學測試。此外，動物實驗替代方法還包括應用於熱源試驗、疫苗生產、生物製品測試等醫療領域的方法。這些方法被歐洲藥典、人用藥品註冊技術要求國際協調委員會（ICH）等法規接受。例如脊髓灰質炎疫苗的毒力測試廢除了猴子實驗，改用體外培養的細胞。生物製品的熱源實驗廢除了兔子實驗，改用血細胞測試等。
表2 驗證和法規接受的替代方法
表2 驗證和法規接受的替代方法（續）
以ECVAM的成立為標誌，監管機構接受替代方法的速度明顯加快，但總體但仍不能滿足工業界和科學界風險評估的需要。歐洲消費者保護委員會（SCCS）2015年發布的第9版指南中明確指出：除了經驗證的替代法，對於個案，SCCS可以接受一些科學有效的方法和新方法用於化妝品成分的安全評估。化妝品的應用情況表明，生物醫藥研究和產品評價對於替代方法的使用存在巨大需要，開發進度仍需加快。
中國在替代方法的標準認可方面也跟隨了國際標準的發展趨勢，例如化學品安全評價中國家標準（表3）已等同採用了替代方法，如《GB/T21769—2008化學品體外3T3中性紅攝取光毒性試驗方法》和《GB/T 27830—2011化學品體外皮膚腐蝕人體皮膚模型試驗方法》等。國家質檢總局作為進出口商品的專職檢驗檢疫監管機構，於2005年率先啟動了替代方法系列標準的研製工作，為此，國家認證認可監督管理委員會成立了化妝品行業標準專家委員會，目前已發布相關替代方法標準共18項（表3），這批標準填補了國內相關標準的空白，並在檢驗檢測工作中得到廣泛應用。
表3 中國已發布的替代方法國家標準和行業標準
表3 中國已發布的替代方法國家標準和行業標準（續）
快速發展階段（2013—）
新理論提出
動物實驗替代技術在現代科學技術的推動下不斷發展，特別是在毒理學領域，面臨工業化帶來的全球化學品評估的問題，製藥工業發展帶來的新葯臨床前安全評價問題，健康相關產業發展帶來的環境和生態評價的問題等。2007年，美國國立研究院（NRC）提出了《Toxicity testing in the 21st century: A vision and a strategy》（《21世紀毒性測試-遠景和策略》）的報告（簡稱TT21C），提出毒性測試應當由原來的體內動物研究向體外試驗轉變。TT21C發布的近10年來，各種策略和模式被提出，以實現報告提出的願景。其中，有害結局通路（adverse outcome pathway，AOP）概念是實現TT21C預期目標的有效策略。
AOP是一個概念框架，用於描述已有的關於一個直接的分子起始事件與生物體不同組織結構層次（如細胞、器官、機體、群體）所出現的與危險度評定相關的「有害結局」之間的相互聯繫。2013年以後，OECD相繼發布了指南文件和用戶手冊，用於指導AOP的開發。2014年9月發布了「AOP知識庫」，用於促進對AOP研究的統一協調、優勢互補和信息共享，發布了和AOP Wiki、Effectopedia和AOPXplorer，藉助互聯網技術為AOP的開發提供可以高效共享和協調互補的平台。在AOP指導下，目前已成功建立了測試皮膚致敏的替代方法。截至2017年10月，AOP Wiki發布的有害結局達232個，提出關鍵事件1734個，成為替代方法開發的源泉。
新戰略推進
TT21C理念提出10年來，累計已投入資金超過數百億美元。2008年，由NTP聯合NIH化學物基因組中心（NCGC）和EPA成立了21世紀毒理學（Tox21）協作計劃，協調各方在實驗毒理學、體外試驗和計算毒理學方面的優勢，達到快速踐行TT21C觀念的目的。在新理論的帶領下，歐美政府、工業界（藥物、化學、化妝品和消費品）、基金會等相關機構發布了多項龐大的計劃，如歐盟框架計劃（FP）、創新藥物計劃（Innovative Medicine Initiative，IMI），美國關鍵路徑計劃（Critical Path Institute，CPI）、21世紀毒理學（Tox21）、地平線2020計劃等。迎接毒理學新時代的到來。
標準方法的改進和組合
目前，國內外發布的替代方法標準已基本能滿足化妝品安全性評價的需要，對於工業化學品的部分毒性評價也能提供基本的測試數據。但在實際應用中仍需要積累數據，進行必要的優化和調整，以適合不同行業和企業的需要。例如，雞胚尿囊膜血管方法（CAMVA）、BCOP方法和Episkin皮膚刺激方法等幾項經典的替代方法可用於化學品分類和標識。但這些方法在具體使用中如何用於個人護理產品的評估，以及滿足護膚品、彩妝、嬰童、家居護理（清洗劑、清新劑）、消毒產品等多樣化的消費品的測試，常常出現標準化的方法不能滿足產品的差異化、產品溫和的宣稱以及特殊人群的需求。使用者可以通過增加檢測參數、改變暴露方式、修改預測模型和組合等不同方法提高方法的特殊性。而且，需要分析每個替代方法的適用性和局限性，建立整合策略，在應用中不斷創新替代方法的應用水平。
新技術應用
傳統的替代技術，主要體現為動物實驗系統向體外實驗系統的轉換而建立的方法，如利用體外培養的細胞和組織、離體的材料和重建的組織/器官，建立「一對一」的替代方法（表2）。現代研發中的替代方法，體現在充分利用先進技術的精華並加以整合，如標誌技術、分子生物學、組學技術（基因組、蛋白組、代謝組、細胞組）、組織工程技術、幹細胞技術、圖像分析、高通量試驗、計算機模擬技術等，替代方法更複雜化、多元化，也更有邏輯性和更接近人作為整體的實際情況。
非生物測試方法。非測試方法（non-testing methods）通常是指任何基於計算機開發的預測方法。主要包括定量構效關係（structure-activity relationship）、分類法（grouping approaches）、交叉參照（read-across）、毒理學閾值（threshold of toxicological concern，TTC）和專家系統（expert systems）等。這些方法在OECD、歐盟、美國和日本等國家和地區發展較快，已經有不少QSAR模型和工具應用到毒理學安全性評估中，例如，OECD QSAR Toolbox、Toxtree、CAESAR、TEST及HESS等，毒性終點涉及經皮吸收、皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏、急性毒性、重複劑量染毒、生殖發育、遺傳和致癌等。在工業化學品領域，交叉參照已被多個國家的管理機構接受。總的來說，中國化妝品非測試方法的認識剛起步，開發和應用與國外還存在一定差距，需要更多的經驗積累和借鑒。
組學技術。2003年，人類基因組計劃（Human Genome Project，HGP）的所有目標全部實現，這標誌著後基因組時代正式開始。隨著基因組學（DNA序列）、轉錄組學（基因表達描述）的蛋白質組學（基因表達產物）、代謝組學（代謝產物識別）、細胞組學等技術的飛速發展，並結合不斷發展的生物信息學，為毒理學替代方法的快速發展創造了一個難得的機會。組學技術應用於替代方法的開發主要有以下優勢：1）充分利用人源細胞或幹細胞進行體外試驗，與人的相關性更高，有助於推動建立更有效的安全性評估策略和毒性預測技術；2）將基因表達作為了解生物學過程的指標，有可能在亞臨床水平或低劑量下進行體外測定，發現不同與以往病理學或臨床效應的指標，可能更相關和更適宜；3）如果不同的試驗系統具有相同的基因表達，那麼，動物試驗就會減少，體外試驗增加，而且後者更易標準化和廣泛應用。
新型體外試驗系統。實驗用組織工程皮膚的構建技術始於20世紀90年代，從2D原代細胞培養起步，到生物材料的開發，再發展到三維皮膚模型重建，經歷了30多年的歷史。體外重建皮膚技術的成熟直接推動了替代方法發展，如現有法規可認可的眼刺激的重建角膜方法、皮膚腐蝕的皮膚模型方法等。目前商品化和實驗室自行構建的皮膚模型，基本可滿足科學研究、產品開發和檢驗檢測的需要。
今後，替代技術將向更複雜的系統性毒性和靶器官毒性深入，很大程度上依賴於先進體外試驗系統的建立。因此，重點關注的領域是如何在體外構建複雜器官，發揮3D列印在硬體和微量精確控制方面的優勢，加上多細胞培養技術的起步，可以在體外重建含有多種細胞類型的3D器官，如肝臟、腎臟、中樞神經和心臟系統。隨著微流控技術、組織微織造技術和精準實驗體系構建技術的發展，基於多器官人體晶元的技術，為系統毒理學的替代方法建立提供了條件。目前，循環、內分泌、胃腸、免疫、表皮系統、肌肉骨骼、神經、生殖、呼吸和排尿系統的器官晶元已有商業化產品。人體晶元技術的開發，可以實現在人體組織中檢測新葯安全性和功效，闡明組織對化合物的反應機制，更好地模擬器官的生理特性和細胞之間的相互作用，更好的開發疫苗、生物產品和新葯，實現更精準的代替傳統動物實驗。2017年4月美國食品藥品監督管理局（FDA）已經測試了波士頓生物技術公司Emulate製造的同型肝臟晶元。嘗試採取晶元器官代替動物測試用於新葯研發，為法規接受人體晶元技術進行了嘗試。
幹細胞研究。利用幹細胞研究取得的巨大進步，以及體細胞重編程產生多能幹細胞（誘導的多能幹細胞，iPSCs）的技術，為替代方法的研究提供了穩定的人類幹細胞衍生細胞的來源，有望解決物種間外推的需要。無論是胚胎幹細胞（ESC或iPSCs），還是神經幹細胞都有開發用於毒性測試的替代方法。早在1997年，德國動物試驗替代方法評價中心（ZEBET）就建立了利用兩種小鼠細胞系（成纖維細胞3T3和胚胎幹細胞D3）進行胚胎毒性測試的替代方法（EST方法），2003年，EST方法通過了ECVAM的驗證，用於胚胎和發育毒性的預測。近年來，傳統的EST方法已取得了重要進展，例如採用iPS技術解決了人胚胎幹細胞來源困難的問題；基於心肌分化蛋白的流式細胞分析方法提高了檢測的效率。這些技術上的改進提高了EST方法的適用範圍。同時，也為幹細胞技術應用於其他毒性測試替代方法的研發提供了參考。
高內涵和高通量技術。替代方法的開發與檢測技術的進步密不可分，特別是隨著測試系統的複雜化，毒性效應參數的增多和檢測樣品多樣化。可利用高通量（high throughput screening，HTS）和高內涵篩查（high content screehing，HTC）技術，是基於分子水平和細胞水平的活性評價方法（模型），以微板形式作為實驗工具載體，通過自動化操作系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器採集實驗結果數據，以計算機分析處理實驗數據，實現在短時間內對數千種樣品進行生物活性等檢測的技術體系。HTS的最大優勢是實質性地減少昂貴的動物使用和花費。此外，還可以檢測化學物在不同的體外實驗系統中暴露的生物學反應。
結 論
3R原則提出50多年來，實驗動物替代技術在科學、社會和法規的多重推動下取得了重要進步。其中科學技術起到了驅動作用，正是得益於現代科技技術的飛速發展，再加上立法的約束力，使得替代動物實驗不再只是空洞的口號，而成為實驗動物學科的重要發展方向之一。近30年來，現代科技的發展推動了包括實驗動物科學、毒理學和藥學等在內的一切生命學科的變革，替代技術呈現多學科交叉滲透的趨勢。諸如計算機預測、仿生材料、人類基因組、蛋白組學、人工器官、幹細胞技術、人體晶元、高通量技術等人們已耳熟能詳的辭彙和技術，深刻地影響著人們的生活以及人們對待動物的方式。可以說現代科技賦予了動物福利新的內涵，為動物實驗替代找到了得以實踐的途徑。促使近10年來，實驗動物替代的規模和技術體系得以不斷發展和完善。替代技術已影響到人們的日常生活，包括藥品、疫苗、生物製品、醫療器械等醫療領域，以及化妝品、化學品和農藥的安全測試。這些方法的使用不僅取代了實驗動物的使用，使人類自身獲益，也極大地促進了體外科學技術的蓬勃發展和應用，實現科技進步與倫理進步並行。
中國在動物替代技術研究和方法推行方面起步較晚，但近年來已取得了可喜的進步。例如國家質檢總局、疾控機構和行業主管機構如起草和發布了一些檢測標準，開展一些跟蹤研究，部分官方檢測機構和第三方機構已具備提供技術服務的能力。2007年替代方法研究評價中心（CCARE）建立了中國首個網路數據共享平台。2013年首個按照國際標準執行的替代方法驗證研究也順利完成。替代方法的學術交流和實驗室培訓也持續開展，中國正在逐步縮小與發達國家的差距。
作者簡介：程樹軍，廣東出入境檢驗檢疫局技術中心，研究員，研究方向為動物實驗替代方法研發及標準化。
（責任編輯 劉志遠）
注：本文發表在2017年第24期《科技導報》，歡迎關注。本文部分圖片來自互聯網，版權事宜未及落實，歡迎圖片作者與我們聯繫稿酬事宜。
《科技導報》
中國科協學術會刊
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