清華陳春來課題組發表論文報道CRISPR/Cas9蛋白切割DNA過程中的調控和校驗機制

2018年1月9日，清華大學生命科學學院陳春來研究組在《Cell Reports》雜誌發表了研究論文，題目為「The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET」（利用單分子FRET揭示Cas9在DNA切割過程中的動態構象）。該論文展示了Cas9可以自發地在三種主要構象中轉換，揭示了Cas9蛋白與PAM遠端DNA/RNA雙鏈相互作用可長程別構調控Cas9切割結構域的局部構象，這是Cas9切割靶標DNA之前的最後校驗步驟。最後，該文提出了優化和設計高保真Cas9的新思路，即通過突變Cas9蛋白以影響這種長程別構調控機制，可提高Cas9的識別特異性。

CIRSPR/Cas9是一種可以由一條單鏈sgRNA（single guide RNA）指導的利用Cas9核酸酶對靶向DNA進行特異性識別和切割的技術。由於其可以高效快捷地靶向切割DNA而被廣泛地應用於基因編輯、基因表達調控、基因定位和成像等領域。但是，Cas9的脫靶效應嚴重阻礙了其應用。儘管有一些研究報道了通過改造Cas9和截短sgRNA來提高其特異性，但仍然缺乏對Cas9切割靶標DNA的詳細分子機制的全面認知，因而難以對CIRSPR/Cas9的優化提供系統性的指導。

單分子熒光共振能量轉移技術（FRET）是檢測生物大分子構象變化的有利工具。該研究通過在Cas9蛋白的特異位點上標記熒光團，基於全內反射熒光顯微鏡快速靈敏地捕捉單個Cas9分子的FRET效率變化以及在每個FRET狀態的停留時間，以此反應Cas9的構象變化，並提供該過程中的一系列動力學參數。該研究發現，Cas9展現出三種構象狀態，並可以自發的在這三種狀態中自由切換。靶標序列的PAM遠端與sgRNA的大於三個鹼基的錯配，導致Cas9的HNH結構域（核酸切割結構域）稍偏離了其正確切割位點，因而將其從切割活性態轉化為非活性狀態。而這種對錯配的校驗機制是Cas9蛋白與PAM遠端DNA/RNA雙鏈相互作用對其HNH結構域的長程別構調控來實現的。

圖1. Cas9蛋白切割靶標DNA的動態動態構象和校驗機制模型

通過對Cas9一些高保真突變體的研究，該文章證明了在Cas9/RNA/DNA三聚複合物中引入額外的能量損耗導致Cas9切割底物的能壘升高，從而提高了Cas9切割特異性。該文章為優化Cas9特異性提供了新思路，即通過減弱Cas9與PAM遠端DNA/RNA異源雙鏈的相互作用來提高切割能壘，從而達到提高特異性的目的。

清華大學生命科學學院陳春來研究員為本文通訊作者。清華大學生命學院CLS項目三年級博士生楊夢銥，清華大學生命學院三年級直博生彭思佳為共同第一作者。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創新中心、清華-北大生命科學聯合中心及國家自然科學基金委的經費支持。

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