驚人！中國科學家發現人類環狀RNA類似病毒RNA翻譯功能性蛋白

2018年1月18日，國際學術刊物Nature子刊腫瘤學專業期刊《Oncogene》雜誌在線發表了中山大學附屬第一醫院張弩副教授科研團隊的題為「A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis」的研究論文。

研究團隊發現由抑癌基因SHPRH的26-29四個外顯子形成的環狀RNA分子具有編碼蛋白的能力，環狀RNA編碼的小蛋白可以充當母基因的「保鏢」，通過泛素化途徑保護全長母蛋白，從而發揮抑制腫瘤的作用。LncRNA及circRNA作為可翻譯RNA也少量報道，這些報道揭示了這類RNA作為可編碼RNA在機體中扮演新的重要角色，刷新了我們對於「非編碼RNA」認識。本研究發現的環狀RNA 分子更具特色，就像研究團隊說的「Interestingly, the translation pattern of circ-SHPRH is quite similar to that of the covalently closed circular (CCC) RNA of the virusoid associated with rice yellow mottle virus」發現的來自高等生物人類的RNA分子，也能像病毒的RNA分子一樣利用重疊的密碼子精打細算的翻譯蛋白質發揮重要的生物學功能，此發現在國際上尚屬首次。本報道對於環狀RNA的生物學功能機制研究具有重要的意義。

此項研究得到中國國家重點研發計劃青年科學家項目「環狀RNA翻譯蛋白質的調控過程與生物學功能」等項目的資助，所有工作均在中國獨立完成。文章第一作者為研究助理張茂雷、助理研究員黃努努博士、楊雪松博士和羅景燕博士， 通訊作者張弩教授主攻方向為中樞神經系統腫瘤的臨床與轉化研究，前期已獲得國家自然科學基金、廣東省特支計劃青年拔尖人才、廣東省自然科學傑出青年基金等基金的支持。下一階段，團隊將繼續圍繞環狀RNA翻譯蛋白質這一領域進一步探索，為環狀RNA編碼的蛋白質在惡性膠質瘤以及其他惡性腫瘤中的作用提供全新的參考，並探索這一類環狀RNA及其編碼的蛋白質在惡性腫瘤診斷、預後及靶向治療的前景。

山人認為該文相比之前的研究又進了一步，首次發現了人類環狀RNA分子可以像病毒RNA分子一樣可以利用重疊密碼子進行翻譯蛋白質，發揮重要的生物學功能，新意突出！下面就讓我們通過拜讀這篇大作，一起學習下。

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鎖定要研究的目標circRNA分子

Fig.1環狀RNA circ-SHPRH發現識別鑒定（來自[1]）

作者通過對腦膠質瘤臨床組織標本進行circRNA深度測序及生物信息學分析挖掘，發現了一些在腦組織以及癌旁組織中有明顯表達差異的circRNA，研究者通過對大樣品進行基因檢測發現環狀RNA circ-SHPRH基因在腦腫瘤中明顯表達降低。circ-SHPRH是源於母基因SHPRH的第26—29的4 個外顯子環化形成的 440nt的環狀 RNA分子。研究者通過sanger測序、Northern blot、FISH等常規實驗技術手段證實了circ-SHPRH內源性的客觀存在及亞細定位。

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怎麼證實circRNA翻譯蛋白質？

Fig.2a 環狀RNA circ-SHPRH翻譯蛋白質的發現（來自[1]）

作者通過分析發現在circ-SHPRH中存一個非常有特點類似水稻黃斑病毒（rice yellow mottle virus (sobemovirus) (RYMV)）的翻譯開放閱讀框（ORF），閱讀框中採用了『UGAUGA』重疊的密碼子起始和終止翻譯（雙終止子），和病毒的非常類似的現象發生在高等生命體中，整個環狀RNA 可以說沒有浪費一個核酸鹼基，讓人驚嘆，生物是多麼的精打細算利用有限的資源！

補充了解：Rice yellow mottle virus (sobemovirus) (RYMV) 的擬病毒可造成水稻黃斑病變。該病毒由220nt的閉合環狀RNA構成，RYMV編碼蛋白的機制非常有特點，我們可以分析發現其中玄妙之處：如果220nt全部作為密碼子，最多可編碼73個氨基酸，按照每個氨基酸分子量110估計，73個氨基酸最多只有8kD左右大小，實際情況是該擬病毒編碼了一中16kD的蛋白！玄妙之處在於它採用了一種重疊編碼的策略，就是在第一次走完環狀RNA全部序列之後在起始密碼子前的一個鹼基和起始密碼子的「AU」繼續作為ORF的密碼子進行第二輪編碼，再次到達起始位點的時候，原先起始密碼子的「A」與前面的兩個鹼基「UG」構成了第一終止密碼子，後面還有第二和第三終止密碼子存在，因此個別情況下還會表達出18kD或23kD大小的蛋白。這一文章的發現非常奇特，也只有在環狀的分子形式才可能出現重疊密碼子的情況。

Fig.2b 環狀RNA circ-SHPRH翻譯蛋白質的發現（來自[1]）

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circ-SHPRH翻譯的蛋白質協同母基因發揮生物學作用

Fig.3 環狀RNA circ-SHPRH翻譯蛋白質分子機制（來自[1]）

母基因SHPRH蛋白是一種E3泛素連接酶，能特異性介導PCNA的泛素化降解過程。作者首先嘗試在細胞系中過表達SHPRH-146aa，並分析了對PCNA的影響情況，發現過表達SHPRH-146aa後也會減少PCNA的蛋白表達量，但不影響PCNA的RNA量，這說明SHPRH-146aa與全長SHPRH類似，也對蛋白泛素化作用通路有影響。蛋白酶體抑製劑MG132能緩解過表達SHPRH-146aa的作用，因此將SHPRH-146aa的作用機制聚焦在泛素化作用通路上。

更有趣的是，過表達SHPRH-146aa後，全長的SHPRH蛋白也增多了，但其RNA並沒有受到影響，干擾SHPRH-146aa後SHPRH全長蛋白也跟著降低了，RNA並未受到太大的影響，同時PCNA蛋白也增高了。這些結果暗示SHPRH-146aa或許通過穩定全長SHPRH蛋白而發揮作用。驗證這一假設的有效實驗是通過添加放線菌酮（CHX）阻斷新蛋白的合成，看隨著時間延長，內源全長SHPRH蛋白的變化情況。實驗結果證明了上述的假設，過表達SHPRH-146aa的確延長了全長SHPRH蛋白的半衰期。CoIP實驗也證明了 SHPRH-146aa和全長SHPRH存在相互作用。通過進一步的發現，研究者發現全長母基因表達的蛋白SHPRH也是受泛素化修飾然後受到降解，環狀RNA circ-SHPRH表達的小的蛋白質能有效的保護全長母基因，提高母基因全長蛋白的穩定性，我們感嘆細胞太聰明了，「小蛋白能為母親擋子彈，保護母親全長蛋白免受降解」！

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作者分析了臨床標本中SHPRH-146aa的表達量及在細胞動物模型中證明SHPRH-146aa對膠質瘤成瘤性的影響情況。結果顯示環狀RNA SHPRH翻譯的小蛋白質對腫瘤的生長有明顯的抑制作用。

Fig.4 環狀RNA circ-SHPRH翻譯蛋白質生物學功能及臨床意義（來自[1]）

本文的工作再一次證實了來自高等生物的環狀RNA 可以像病毒分子一樣翻譯具有生物學功能的蛋白，更是首次報道人類內源性的circRNA分子可以利用重疊密碼子翻譯蛋白。（重疊密碼子使用的現象偶爾會見到在病毒等低等生物的基因組中），那麼類似的現象會不會還在其他circRNA中存在？高等生物中存在的海量環狀RNA分子還具有那些重要的生物學功能？以前傳統的認識需要陸續被研究者打破，期待我們科研工作者的研究來揭示生命的深層次奧秘，為人類的健康事業做出貢獻~

參考文獻：

1.Maolei Zhang, N.H., Xuesong Yang, Jingyan Luo, Sheng Yan, Feizhe Xiao, Wenping Chen, Xinya Gao, Kun Zhao, Huangkai Zhou, Ziqiang Li, Liu Ming, Bo Xie, Nu Zhang, A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene, 2018.

2.AbouHaidar, M.G., Venkataraman, S., Golshani, A., Liu, B., and Ahmad, T. (2014). Novel coding, translation, and gene ex pression of a replicating covalently closed circular RNA of 220 nt. Proc Natl Acad Sci U S A.

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