研究熱點——CRISPR-Cas9系統

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CRISPR Cas9（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9）是最近幾年興起用於靶向基因特定DNA修飾的重要工具。本文從CRISPR Cas9起源、CRISPER-Cas9系統的組成、CRISPER-Cas9系統的作用機制三方面為您介紹系統CRISPR Cas9技術。此外關於CRISPR Cas9技術的更多專題介紹後續將不斷更新。

CRISPR Cas9起源

CRISPRCas9系統最初在細菌和古細菌中被發現，是一種細菌應對外來病毒或質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防禦機制。

當外源DNA首次侵入細菌時，外源DNA被Cas核酸酶切割，並以間隔序列形式整合到CRISPR基因座中。當外源DNA再次入侵時，細菌會以間隔序列作為模板形成短的CRISPR RNA（crRNA），crRNA與反式激活crRNA（tracrRNA）形成複合RNA：該複合RNA作為引導鏈指導Cas9核酸酶結合到互補的外源DNA。

一旦結合，Cas9蛋白通過其NHN和RuvC1樣核酸酶結構域分別切割外源DNA的兩條鏈，使外源DNA降解。

Figure 1 – TheCRISPR Locus and its use as an adaptive immune system. a) Invading DNA arecleaved by the CAS gene products and incorporated into the CRISPR Locus asspacer sequences. Different spacer sequences are separated by conserved repeatsequences. b) Once the same invading DNA is detected in the cell, the spacerDNA is expressed in the form of crRNA. The crRNA then complexes with tracrRNAand guides the Cas endonuclease to the foreign DNA for degradation.

迄今為止，已經發現了45種不同的Cas蛋白家族，每種家族在crRNA的合成、間隔序列的整合以及外源DNA的切割方式上有明顯的不同。

根據Cas9蛋白的序列和結構不同，CRISPER-Cas9分為三類：I型，II型和III型。目前常用於基因組編輯的CRISPRCas9系統是改良自釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）的II型CRISPRCas系統。

CRISPER-Cas9系統的組成

CRISPRCas9靶向基因組編輯系統有兩個組成部分：內切核酸酶-Cas9和指導RNA-gRNA。

內切核酸酶是來自釀膿鏈球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的活性結構域（RuvC1和HNH樣核酸酶結構域），使得雙鏈DNA斷裂。

gRNA是由起支架功能的tracrRNA與特異性的crRNA結合形成的嵌合RNA。後來，人們將這兩段RNA拼接成一條短RNA，稱為sgRNA。

gRNA 5"末端的20bp是特異性的結合序列-尋靶裝置，通過RNA-DNA鹼基配對將Cas9 / gRNA複合物募集到特異的DNA靶點。

特異性結合序列相鄰的是PAM（Protospacer Adjacent Motif）基序。PAM基序是內切核酸酶Cas9的識別位點，Cas9的PAM基序為5"-NGG。Cas9核酸酶在PAM基序上游第3個鹼基處切割雙鏈DNA。

Figure 2 – The last 20 base pairs of thegRNA acts as a homing device, recruiting the Cas9 endonuclease to theappropriate target sequence. Once there, the two cleavage domains of the Cas9create a double stranded break 3 or 4 base pairs downstream of the PAMsequence. The DSB is then repaired by either the error-prone non-homologous endjoining repair pathway, or the template-dependent homology directed repair

CRISPER-Cas9系統的作用機制

CRISPR Cas9系統產生雙鏈DNA缺口後，生物體內一般通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）這兩種修復方式對斷裂的雙鏈DNA進行修復。

修復方式一：非同源末端連接修復途徑（NHEJ）

NHEJ修復途徑是一種錯誤傾向修復機制，用於在缺少修復模板的情況下修復斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用於CRISPR Cas9系統介導的基因沉默。主要用於當DNA發生斷裂時，NHEJ修復途徑被開啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個鹼基，然後雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個過程極容易導致切割位點發生移碼突變，從而沉默該基因。因此，在沉默編碼基因時， gRNA應靶向基因的N端來確保最大程度的基因破壞。

Figure3 – The non-homologous end joining repair mechanism attempts to ligate the endsof the DSB together without the use of a homologous template. This process iserror prone as the loss or addition of a few nucleotides is inevitable withthis mechanism. As a result NHEJ creates InDel mutations which either disruptthe reading frame of the gene or introduce premature stop codons.

修復方式二：同源性定向修復（HDR）

對比NHEJ修復途徑，同源性定向修復（HDR）途徑是更為精確的修復機制。這種修復機制主要用於CRISPR Cas9系統介導的基因敲入。在該修復路徑中，需要將一段與預期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中。在高度同源性DNA模板存在的情況下，HDR機制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點。這種修復方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點。

Figure 4 – In thepresence of a suitable repair template containing homology arms directlyupstream and downstream of the double stranded break, the recombination-basedhomology directed repair mechanism is used. In this way precise changes—be itadditions or deletion—can be made anywhere in the genome.

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